NGS ライブラリー調製を自動化する方法：手動プロトコルからバリデーション済みワークフローへ

NGS ライブラリー調製では、DNA または RNA をシーケンシングプラットフォームに適合するライブラリーへ変換します。アッセイによっては、断片化またはサイズ選択、二本鎖 DNA への変換、アダプター付加、増幅、クリーンアップ、最終定量などが含まれます。ライブラリーの品質は、複雑性、バイアス、バッチ効果、そして得られる配列データの有用性に影響し得ます（Head et al., 2014）。

自動化により反復的な液体操作を標準化し、ハンズオン作業を減らすことはできます。しかし、ロボットで実行できるというだけで、プロトコルが妥当になるわけではありません。化学系、装置構成、ラボウェア、ソフトウェアメソッド、サンプル種、使用目的は、一体として評価すべき一つの実装を構成します。そのため、NGS 自動化に関するレビューでは、多段階のボトルネックを軽減できる可能性とともに、スループット、柔軟性、品質管理へのアクセス、人員、コストに自動化戦略を適合させる必要性が強調されています（Hess et al., 2020；Socea et al., 2023）。

対象範囲。 本稿は実装とバリデーションのガイドであり、特定キットの標準作業手順書ではありません。使用するライブラリー調製キットと装置に対応する最新の取扱説明書に従ってください。臨床または診断目的で使用する場合は、各検査室に適用される規則に基づくバリデーションも必要です。

移行を構成する 5 つの要素

1. 使用目的と自動化の範囲を定義する。
2. 現行の手動法を明示的な機械命令に変換する。
3. 選定したデッキ上で液体操作と磁気ビーズ操作を開発する。
4. 自動化法を承認済みの手動法と比較し、精密度を試験する。
5. 判定基準、コントロール、保守、変更管理を文書化してからメソッドをリリースする。

これらの手順を成功させるための普遍的な最小バッチサイズ、固定されたバリデーション期間、追加反応数の既定値はありません。これらの値は、アッセイ、リスク、装置、コストモデル、検査室要件によって異なります（Socea et al., 2023）。

1. 装置が行うこと——行わないこと——を定義する

まず、キットの正確なバージョン、サンプル種、インプット範囲、必要なバッチサイズ、シーケンシングプラットフォーム、ワークフローが支援すべき結果を明確にします。次に、どの操作をリキッドハンドラー上に残し、どの操作にオフデッキ装置または人による移送が必要かを決定します。NGS 自動化に単一のアーキテクチャはありません。ワークステーションごとに、ピペッティングヘッド、マグネット、グリッパー、シェーカー、温度制御、サーマルサイクラー、リーダー、デッキ容量、ソフトウェアの柔軟性が異なります（Hess et al., 2020；Socea et al., 2023）。

PCR や QC を一律に「手動」と呼んではいけません。自動化されているシステムもあれば、オフデッキで実施するシステムもあります。同様に、オプションモジュールが実際に設置され、適格性が確認されていない限り、その機能を装置が備えていると記載すべきではありません。

2. 手動プロトコルを機械可読メソッドに変換する

手動プロトコルには、「十分に混合する」「透明になるまで待つ」「ペレットを乱さない」といった文言の中に判断が隠れていることがあります。機械用メソッドでは、このような判断を明示的で検証可能なパラメーターに置き換える必要があります。各工程について、少なくとも次の事項を記録します。

• 試薬名、ロットに依存する要件、保管条件、作業容量；
• 移送元・移送先のラボウェア、ウェル形状、プレート方向；
• 吸引・吐出容量、高さ、速度、待機時間、必要に応じたチップのプレウェット；
• 混合容量、速度、サイクル数、プレート待機中にビーズが沈降し得るか；
• インキュベーション設定温度、検証済みサンプル温度、時間、蓋またはシール、移送時間；
• マグネットの種類、プレート適合性、分離終了点、ペレット位置、吸引経路；
• チップ方針、PCR 前後の分離、汚染管理；
• すべての手動介入、安全停止点、復旧操作、監査ログ項目。

メーカーの取扱説明書は、後で付け足す細部ではなく、設計開始時の制約条件です。たとえば、現行の Illumina DNA Prep 文書では、精製ビーズを室温に戻し、ボルテックスで再懸濁し、粘性のある懸濁液をゆっくり吸引・吐出し、マグネット上で液体が透明になるまで待ち、残留エタノールを除去し、規定された乾燥・再懸濁工程を行うよう指示しています（Illumina DNA Prep, document 1000000025416 v12）。自動化メソッドでは、手作業の動きをそのままロボットへ移せると仮定せず、これらの操作目的を再現しなければなりません。

経験則をコピーせず、余剰量を測定する

試薬の余剰量は、選択したリザーバーの吸引可能残量、ピペッティング挙動、実際のワークフローで生じる損失を補える必要があります。一律の固定追加反応数で安全に定義できるものではありません。Meijers らは、固有の 8 サンプル自動化法で 4 サンプル分に相当する余剰試薬を使用しました。一方、Illumina DNA Prep の手動プロトコルでは、クリーンアップ工程用エタノールの調製時に 20% の余剰量を指定しています。いずれも実装固有の例であり、一般的な既定値ではありません（Meijers et al., 2024；Illumina DNA Prep v12）。

3. 磁気ビーズ操作を管理された工程として扱う

固相可逆的固定化（SPRI）は、ポリエチレングリコールと塩の存在下で DNA がカルボキシル化磁性粒子へ可逆的に結合する方法として最初に報告され、自動化に対応するよう設計された 96 ウェル PCR 産物精製法が用いられました（DeAngelis et al., 1995）。この基礎論文は、現代の NGS キットに共通するビーズ比、断片サイズのカットオフ、乾燥時間、アダプターダイマー除去規則を確立したものではありません。

使用する正確なキットについて、次の事項を開発し、検証します。

• 分注前および分注中に、ビーズを均一な懸濁状態へ戻す方法；
• メソッドで指定されたビーズ対サンプル比と添加順序；
• 過度の発泡やエアロゾル発生を避けながら回収率を確保する混合；
• 分離時間と、上清が透明になったと判断する基準；
• ペレットを吸引せずに上清を除去するための吸引高さと経路；
• ビーズを過乾燥させずに残留洗浄液を完全に除去する方法；
• 次の移送前に完全に溶出・再懸濁する方法。

これらの変数は相互に作用します。たとえばライブラリー収量の低下は、一律の「ビーズの問題」ではなく、インプット品質、酵素性能、移送損失、残留エタノール、過乾燥、不完全な溶出による場合があります。Illumina は、残留エタノールがアッセイ性能に影響し得ること、洗浄工程でビーズペレットを過乾燥させたり乱したりしないことを特に注意喚起しています（Illumina DNA Prep v12）。

アダプターダイマーにも複数の原因があります。アダプターダイマーは、目的のインサートを含まず完全長のアダプター配列を含み、フローセル上でクラスター形成するためシーケンシング reads を消費します。Illumina は、インプット量の不足、品質不良、非効率なビーズクリーンアップを原因として挙げ、約 120–170 bp に現れる予期しないピークを一般的な徴候として説明しています。ただし、是正処置は対象のライブラリーキットとシーケンシングプラットフォームに従う必要があります（Illumina Knowledge Article #1911）。

4. 比較試験を実施する前にバリデーションを設計する

自動化結果を見る前に判定基準を定義します。研究デザインは、インターネット上の固定チェックリストではなく、対象とするサンプル種と結果を反映すべきです。Socea らは、正確度、反復性、再現性、分析感度・特異度、方法比較、報告可能なエンドポイントを区別しています。また、精密度評価に必要なサンプル数は、各検査室のバリデーション枠組みの中で決定・承認すべきであると述べています（Socea et al., 2023）。

根拠のある比較には、通常、次の内容が含まれます。

1. 方法比較。 一致する材料を、承認済み手動法と候補となる自動化法で調製します。可能な範囲で、インプット材料、試薬ロット、下流のシーケンシング条件を揃えます。
2. 反復性。 同一条件での変動を測るため、同じ run 内でサンプルを反復します。
3. 再現性。 関連する日、担当者、装置、試薬ロット、runs をまたいで反復します。
4. 範囲・チャレンジサンプル。 使用目的で実際に許容されるインプット範囲、サンプルマトリックス、品質状態、難しい条件を含めます。
5. 汚染コントロール。 キャリーオーバーやサンプル取り違えを検出できるよう、陰性コントロールと識別性の高い陽性コントロールを配置します。
6. 不具合対応。 中断、モジュール使用不可、容量不足、QC 不合格、承認済みの復旧手順または安全停止手順を試験します。

ライブラリーと最終結果を結びつける指標を選ぶ

単一の指標だけで同等性を証明することはできません。ライブラリー濃度が許容範囲でも、断片分布、汚染、カバレッジ、アッセイ固有のエンドポイントに問題が生じることがあります。Head らは、ライブラリー構築によってバイアスが生じ、複雑性が低下し、バッチ効果が発生し得ることを論じています。Socea らは、使用目的に応じて QC チェックポイントと結果固有の基準を選ぶ必要性を示しています（Head et al., 2014；Socea et al., 2023）。

公表された比較研究が示すこと——示さないこと

公表研究は研究デザインの有用な例ですが、異なるキット、装置、サンプル種、結果に対するバリデーションの代わりにはなりません。

細菌全ゲノムシーケンシング：flowbot ONE 上の Illumina DNA Prep

Meijers らは、16 件の細菌 DNA 抽出物を手動および自動の Illumina DNA Prep ワークフローで調製しました。そのうち 8 件を、独立した自動化 run でもう一度処理しました。自動化法では、ピペッティング、加熱・冷却、磁気ハードウェアを備えた固有の flowbot ONE デッキを使用しました。PCR チューブストリップはオフデッキのサーマルサイクラーへ移送され、index は手動で添加されました（Meijers et al., 2024）。

この研究では、手動法と自動化法のライブラリー DNA 濃度に中央値で 1.5 倍の差が報告されましたが、値は同一ではありませんでした。ある Klebsiella pneumoniae ライブラリーは、手動調製後に 10.9 ng/µL、自動化調製後に 1.9 ng/µL でした。シーケンシング後、ライブラリー当たり 100 万 reads に正規化すると、アセンブリ指標は類似していました。菌種特異的 cgMLST scheme が利用可能だった 14 株では complex type が 100% 一致し、残る 2 株には適用可能な scheme がありませんでした（Meijers et al., 2024）。

この構成で 8 サンプルを処理した場合、ハンズオン時間は自動化ワークフローで 25 分、手動ワークフローで 125 分でした。所要時間はそれぞれ 170 分と 200 分でした。これは、同研究の構成においてハンズオン時間が 80%、総所要時間が 15% 短縮されたことを意味しますが、NGS ライブラリー調製が普遍的に 5 倍高速化することを意味しません（Meijers et al., 2024）。

mRNA-seq：Biomek i7 上の NEBNext Ultra II Directional RNA

Santacruz らは、2 種類のヒト細胞株由来の RNA サンプル 84 件について、NEBNext Ultra II Directional RNA キットと Biomek i7 を用い、手動調製ライブラリーと自動調製ライブラリーを比較しました。発現プロファイルは高い相関を示したと報告されています。自動化法では、約 2 時間の試薬調製後に 9 時間の無人装置 run を行い、2 日間にまたがる約 12 時間の手動プロトコルを置き換えました。この結果は、研究で用いた 250 ng RNA インプット、細胞株サンプル、キット、ワークステーションに適用されるもので、分解 RNA、低インプット RNA、臨床サンプル、その他の RNA サンプルに対する性能を確立するものではありません（Santacruz et al., 2022；2024 corrigendum）。

単一の原因を決めつけず、観察結果からトラブルシューティングする

複数の要因が同じ症状を生じさせることがあります。根拠のあるパラメーターを一度に一つだけ変更し、不成功 run のエビデンスを保存し、関連比較を再実施してください。「自動化は機能しない」と断定してはいけません。初回リリース後も、定期校正、保守、担当者の力量、QC 監視、スクリプト変更を管理するプロセスが必要です（Socea et al., 2023）。

装置リンク：デッキサイズだけでなくメソッドを評価する

Pize NGS ライブラリー調製アプリケーションページには、関連する 3 種類の自動サンプル調製システムが掲載されています。以下の説明は現在の Pize カタログの要約であり、独立したバリデーションデータではなく、特定キットとの適合性を確立するものでもありません。

「30 ポジション」を「30 サンプル」と解釈したり、オプションモジュールを標準装備として扱ったり、iLab-300R の 384 サンプル磁気ビーズ精製という記載を 384 サンプルの NGS ライブラリー調製という主張に変えたりしてはいけません。正確なスクリプトバージョン、デッキマップ、ラボウェア一覧、バリデーション済みインプット範囲、QC データ、残る手動工程、支援体制、変更管理プロセスを確認してください。より広範な AMTK カタログページは閲覧に役立ちますが、カタログ掲載は提携、規制上の位置付け、個々の検査室への適合性を実証するものではありません。

シーケンシング後：ウェットラボと解析のバリデーションを分ける

Pize は、科学計算と統計解析のための AI コーディングアシスタントです。Pize Code と Positron 上で動作し、SDK としても提供されています。このソフトウェア上の役割は、リキッドハンドラーのメソッドとは別です。Pize が上記装置を制御、適格性確認、統合すると記載してはいけません。下流の解析ワークフローは、ウェットラボワークフローと同様に、それ自体の使用目的に対して文書化し、バリデーションする必要があります。

よくある質問

何サンプルから自動化する価値がありますか？

普遍的な閾値はありません。現在のハンズオン時間、バッチ頻度、再試験率、人員上の制約、試薬・消耗品使用量、保守、装置利用率、バリデーション工数を比較してください。低処理量の検査室は小バッチの迅速処理を重視し、高処理量の検査室は容量を優先する場合があります。適切なバランスはワークフローによって異なります（Socea et al., 2023）。

Illumina または NEB のキットをそのまま自動化できますか？

正確なキットとバージョン、装置構成、ラボウェア、モジュールに対応するメソッドが存在する場合、または検査室がそのようなメソッドを開発してバリデーションした場合に限られます。一つのロボットで機能したプロトコルは、その実装のエビデンスであり、別のプラットフォームへ移せることを保証するものではありません（Hess et al., 2020）。

バリデーションにはどのくらいの期間が必要ですか？

すべての検査室に適用できる、科学的に妥当な固定期間はありません。期間は、使用目的、規制上の負担、サンプルの多様性、判定基準、対応する材料の入手可能性、精度条件の数、不具合調査、研究中のメソッドまたはハードウェア変更の有無によって異なります（Socea et al., 2023）。

自動調製ライブラリーと手動調製ライブラリーの収量は同一であるべきですか？

必ずしもそうではありません。重要なのは、事前に定めた差が、ライブラリー QC、シーケンシング QC、アッセイ固有のエンドポイント全体で許容できるかどうかです。Meijers の研究では全体として同程度の結果が報告された一方、明確な濃度外れ値もありました。そのため、収量が同一だと主張するより、エンドポイントレベルの比較の方が有益です（Meijers et al., 2024）。

「ウォークアウェイ」は人の作業がないという意味ですか？

いいえ。セットアップ、試薬調製、装填、オフデッキ移送、QC、復旧、レビューは手動のままの場合があります。上記 2 研究では、flowbot ONE メソッドにオフデッキ PCR 操作と手動 index 添加が必要であり、Biomek i7 メソッドには 9 時間の装置 run 前に約 2 時間の試薬調製が必要でした（Meijers et al., 2024；Santacruz et al., 2022）。

参考文献

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2. Hess JF, Kohl TA, Kotrová M, Rönsch K, Paprotka T, Mohr V, Hutzenlaub T, Brüggemann M, Zengerle R, Niemann S, Paust N. Library preparation for next generation sequencing: A review of automation strategies. Biotechnology Advances. 2020;41:107537. doi:10.1016/j.biotechadv.2020.107537.
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6. Santacruz D, et al. Corrigendum to “Automation of high-throughput mRNA-seq library preparation: a robust, hands-free and time efficient methodology.” SLAS Discovery. 2024;29(5):100169. doi:10.1016/j.slasd.2024.100169.
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9. Illumina. Adapter dimers: causes, effects, and how to remove them. Knowledge Article #1911. 公式ナレッジ記事.

図のライセンスに関する注記

図 1 と図 2 は、Meijers et al., Scientific Reports 14, 8159 (2024) から Creative Commons Attribution 4.0 International License に基づき転載しています。画像は表示上の縮尺変更を除き改変していません。掲載は、著者、Flow Robotics、Illumina、Springer Nature、その他の記載組織による推奨を意味しません。