كيفية أتمتة تحضير مكتبات NGS: من بروتوكول يدوي إلى سير عمل خاضع للتحقق

يحوّل تحضير مكتبات NGS الحمض النووي DNA أو الحمض النووي الريبي RNA إلى مكتبة متوافقة مع منصة تسلسل. وقد يشمل العمل، بحسب الاختبار، التجزئة أو انتقاء الحجم، والتحويل إلى DNA مزدوج السلسلة، وربط المحولات، والتضخيم، والتنقية، والتقدير الكمي النهائي. ويمكن أن تؤثر جودة المكتبة في التعقيد والانحياز وتأثيرات الدفعات ومدى فائدة بيانات التسلسل الناتجة (Head et al., 2014).

يمكن للأتمتة أن توحّد مناولة السوائل المتكررة وتقلل العمل اليدوي المباشر، لكنها لا تجعل البروتوكول صالحًا لمجرد أن الروبوت يستطيع تنفيذه. فالكيمياء وتهيئة الجهاز والأدوات المخبرية وطريقة البرمجيات ونوع العينة والاستخدام المقصود تشكّل معًا تطبيقًا واحدًا يجب تقييمه بوصفه وحدة متكاملة. لذلك تشدد مراجعات أتمتة NGS على فرصة تقليل عنق الزجاجة متعدد الخطوات، وعلى ضرورة مواءمة استراتيجية الأتمتة مع الإنتاجية والمرونة وإتاحة ضبط الجودة والكوادر والتكلفة في آن واحد (Hess et al., 2020؛ Socea et al., 2023).

النطاق. هذه المقالة دليل للتنفيذ والتحقق، وليست إجراء تشغيل قياسيًا خاصًا بطقم بعينه. اتبع التعليمات الحالية الخاصة بطقم تحضير المكتبة والجهاز المحددين لديك. كما يتطلب الاستخدام السريري أو التشخيصي تحققًا وفق القواعد المطبقة في مختبرك.

الانتقال في خمسة أجزاء

1. تحديد الاستخدام المقصود وحدود الأتمتة.
2. تحويل الطريقة اليدوية الحالية إلى تعليمات صريحة للجهاز.
3. تطوير عمليات مناولة السوائل والخرز المغناطيسي على سطح العمل المختار.
4. مقارنة الطريقة المؤتمتة بالطريقة اليدوية المقبولة واختبار الدقة.
5. عدم إطلاق الطريقة إلا بمعايير قبول موثقة، وضوابط، وصيانة، وإدارة للتغييرات.

لا يوجد حد أدنى عالمي لحجم الدفعة، أو مدة ثابتة للتحقق، أو عدد افتراضي من التفاعلات الإضافية يضمن نجاح هذه الخطوات. فهذه القيم تعتمد على الاختبار والمخاطر والجهاز ونموذج التكلفة ومتطلبات المختبر (Socea et al., 2023).

1. حدّد ما سيفعله الجهاز — وما لن يفعله

ابدأ بالإصدار الدقيق للطقم، وأنواع العينات، ونطاق الإدخال، وأحجام الدفعات المطلوبة، ومنصة التسلسل، والنتيجة التي يجب أن يدعمها سير العمل. ثم حدّد العمليات التي ستبقى على جهاز مناولة السوائل وتلك التي تتطلب جهازًا خارج سطح العمل أو نقلًا يدويًا. لا تتبع أتمتة NGS بنية واحدة؛ إذ تختلف محطات العمل في رؤوس السحب، والمغانط، والقوابض، والهزازات، والتحكم الحراري، وأجهزة التدوير الحراري، والقارئات، وسعة سطح العمل، ومرونة البرمجيات (Hess et al., 2020؛ Socea et al., 2023).

لا تصف PCR أو ضبط الجودة بأنهما «يدويان» بطبيعتهما؛ فهما مؤتمتان في بعض الأنظمة ويجريان خارج سطح العمل في أنظمة أخرى. وبالمثل، لا ينبغي وصف جهاز ذي وحدة اختيارية بأنه يمتلك تلك الوظيفة ما لم تكن الوحدة مثبتة فعليًا ومؤهلة.

2. حوّل البروتوكول اليدوي إلى طريقة قابلة للقراءة آليًا

غالبًا ما يخفي البروتوكول اليدوي قرارات ضمن عبارات مثل «اخلط جيدًا» أو «انتظر حتى يصبح المحلول صافيًا» أو «تجنب إزعاج الراسب». ويجب أن تستبدل طريقة الجهاز هذه الأحكام بمعلمات صريحة قابلة للاختبار. سجّل، على الأقل، ما يلي لكل خطوة:

• اسم الكاشف، والمتطلبات الحساسة للدفعة، وظروف التخزين، وحجم العمل؛
• أدوات المصدر والوجهة، وهندسة البئر، واتجاه الصفيحة؛
• حجم السحب والتوزيع وارتفاعهما وسرعتهما وفترات الانتظار والترطيب المسبق للطرف عند الاقتضاء؛
• حجم الخلط وسرعته وعدد دوراته، وما إذا كان الخرز قد يترسب أثناء انتظار الصفيحة؛
• نقطة ضبط الحضانة، ودرجة حرارة العينة المتحقق منها، والمدة، والغطاء أو الختم، وزمن النقل؛
• نوع المغناطيس، وتوافق الصفيحة، ونقطة نهاية الفصل، وموضع الراسب، ومسار السحب؛
• سياسة الأطراف، والفصل بين ما قبل PCR وما بعده، وضوابط التلوث؛
• كل تدخل يدوي، ونقطة توقف آمنة، وإجراء استرداد، وحقل في سجل التدقيق.

تعليمات الشركة المصنّعة هي القيد الابتدائي، وليست تفصيلًا يضاف لاحقًا. فعلى سبيل المثال، تطلب وثائق Illumina DNA Prep الحالية إحضار خرز التنقية إلى درجة حرارة الغرفة، وخلطه دواميًا لإعادة تعليقه، وسحب المعلق اللزج وتوزيعه ببطء، والانتظار حتى يصفو السائل على المغناطيس، وإزالة الإيثانول المتبقي، واستخدام خطوات تجفيف وإعادة تعليق محددة (Illumina DNA Prep, document 1000000025416 v12). ويجب أن تحقق الطريقة المؤتمتة غرض هذه العمليات من دون افتراض أن الحركة اليدوية تنتقل مباشرة إلى الروبوت.

قِس الزيادة بدلًا من نسخ قاعدة تقريبية

يجب أن تغطي زيادة الكاشف الحجم المتبقي القابل للسحب في الخزان المختار، وسلوك السحب، وخسائر سير العمل الفعلي. ولا يمكن تعريفها بأمان بعدد ثابت وعام من التفاعلات الإضافية. استخدم Meijers وزملاؤه فائضًا من الكاشف يعادل أربع عينات في طريقتهم المؤتمتة الخاصة بثماني عينات، بينما يحدد دليل Illumina DNA Prep زيادة قدرها 20% عند تحضير الإيثانول لخطوة التنقية. كلاهما مثال خاص بتنفيذ بعينه، لا قيمة افتراضية عامة (Meijers et al., 2024؛ Illumina DNA Prep v12).

3. تعامل مع عمليات الخرز المغناطيسي كعملية مضبوطة

وُصف التثبيت العكوس على الطور الصلب (SPRI) أصلًا بأنه ارتباط عكوس للـDNA بجسيمات مغناطيسية كربوكسيلية في وجود البولي إيثيلين غليكول والملح، باستخدام طريقة لتنقية نواتج PCR في صفيحة 96 بئرًا صُممت لتتوافق مع الأتمتة (DeAngelis et al., 1995). ولا تثبت تلك الورقة التأسيسية نسبة خرز عالمية، أو حدًا فاصلًا لحجم الشظايا، أو زمن تجفيف، أو قاعدة لإزالة ثنائيات المحول في أطقم NGS الحديثة.

للطقم الدقيق المستخدم، طوّر وتحقق من:

• كيفية إعادة الخرز إلى معلق متجانس قبل التوزيع وأثناءه؛
• نسبة الخرز إلى العينة وترتيب الإضافة المحددين في الطريقة؛
• خلط يحقق الاسترداد من دون رغوة زائدة أو تكوين هباء؛
• زمن الفصل والمعيار المستخدم لتقرير أن السائل الفوقاني أصبح صافيًا؛
• ارتفاع ومسار السحب اللذين يزيلان السائل الفوقاني من دون جمع الراسب؛
• الإزالة الكاملة لمحلول الغسل المتبقي من دون الإفراط في تجفيف الخرز؛
• الإذابة وإعادة التعليق الكاملتين قبل النقل التالي.

تتفاعل هذه المتغيرات. فقد يعكس انخفاض مردود المكتبة، مثلًا، جودة الإدخال أو أداء الإنزيم أو خسارة النقل أو بقايا الإيثانول أو الإفراط في التجفيف أو عدم اكتمال الإذابة، لا «مشكلة خرز» عالمية واحدة. وتحذر Illumina تحديدًا من أن الإيثانول المتبقي قد يؤثر في أداء الاختبار، ومن ضرورة عدم الإفراط في تجفيف رواسب الخرز أو إزعاجها أثناء خطوات الغسل (Illumina DNA Prep v12).

لثنائيات المحول أيضًا أسباب محتملة متعددة. فهي تحتوي على تسلسلات المحول كاملة من دون القطعة المراد إدراجها، ويمكن أن تستهلك قراءات التسلسل لأنها تتجمع على خلية التدفق. تدرج Illumina انخفاض الإدخال أو رداءته وعدم كفاءة التنقية بالخرز بين الأسباب، وتصف قمة غير متوقعة قرب 120–170 bp بأنها علامة شائعة؛ ومع ذلك يجب أن يتبع الإجراء التصحيحي طقم المكتبة ومنصة التسلسل المحددين (Illumina Knowledge Article #1911).

4. صمّم التحقق قبل إجراء المقارنة

حدّد معايير القبول قبل الاطلاع على النتائج المؤتمتة. ويجب أن يعكس تصميم الدراسة أنواع العينات والنتيجة المقصودتين، لا قائمة ثابتة من الإنترنت. يميز Socea وزملاؤه بين الصحة، وقابلية التكرار داخل الظروف نفسها، وقابلية إعادة الإنتاج عبر الظروف، والحساسية والنوعية التحليليتين، ومقارنة الطرق، ونقطة النهاية القابلة للإبلاغ؛ ويذكرون أيضًا أن أعداد العينات اللازمة لقياس الدقة ينبغي أن تُحدد وتُعتمد ضمن إطار التحقق الخاص بكل مختبر (Socea et al., 2023).

تتضمن المقارنة القابلة للدفاع عنها عادةً:

1. مقارنة الطرق. حضّر مادة متطابقة بالطريقة اليدوية المقبولة والطريقة المؤتمتة المرشحة. وحّد مادة الإدخال ودفعات الكواشف وظروف التسلسل اللاحقة حيثما أمكن.
2. قابلية التكرار. كرر العينات داخل تشغيل واحد لقياس التباين تحت الظروف نفسها.
3. قابلية إعادة الإنتاج. كرر عبر الأيام أو المشغلين أو الأجهزة أو دفعات الكواشف أو مرات التشغيل ذات الصلة.
4. النطاق وعينات التحدي. مثّل نطاق الإدخال ومصفوفات العينات وحالات الجودة والظروف الصعبة التي يسمح بها الاستخدام المقصود فعليًا.
5. ضوابط التلوث. ضع ضوابط سلبية وإيجابيات مفيدة بحيث يمكن اكتشاف التلوث المرحّل وتبديل العينات.
6. التعامل مع الفشل. اختبر الانقطاعات، والوحدات غير المتاحة، والحجم غير الكافي، وفشل QC، وأي إجراء معتمد للاسترداد أو التوقف الآمن.

اختر مقاييس تصل المكتبة بالنتيجة النهائية

لا يثبت مقياس واحد التكافؤ. فقد يبدو تركيز المكتبة مقبولًا بينما يفشل توزيع الشظايا أو التلوث أو التغطية أو نقطة النهاية الخاصة بالاختبار. يناقش Head وزملاؤه كيف يمكن لبناء المكتبة أن يدخل الانحياز ويقلل التعقيد ويحدث تأثيرات دفعات، بينما يبين Socea وزملاؤه سبب وجوب اختيار نقاط تحقق QC ومعايير خاصة بالنتيجة للاختبار المقصود (Head et al., 2014؛ Socea et al., 2023).

ما الذي تظهره المقارنات المنشورة — وما الذي لا تظهره

الدراسات المنشورة أمثلة مفيدة لتصميم الدراسة، لكنها لا تغني عن التحقق من طقم أو جهاز أو نوع عينة أو نتيجة مختلفة.

تسلسل الجينوم الكامل للبكتيريا: Illumina DNA Prep على flowbot ONE

حضّر Meijers وزملاؤه 16 مستخلص DNA بكتيريًا باستخدام سيري عمل Illumina DNA Prep اليدوي والمؤتمت. وعولج ثمانية من هذه المستخلصات مرة أخرى في تشغيل مؤتمت مستقل. استخدمت الطريقة المؤتمتة سطح flowbot ONE محددًا مع عتاد للسحب والتسخين/التبريد والمغناطيس؛ ونُقلت شرائط أنابيب PCR إلى جهاز تدوير حراري خارج سطح العمل، وأضيفت الفهارس يدويًا (Meijers et al., 2024).

أبلغت الدراسة عن فرق بوسيط قدره 1.5 ضعف في تركيز DNA المكتبة بين الطريقتين اليدوية والمؤتمتة، لكن القيم لم تكن متطابقة: فقد قيس تركيز إحدى مكتبات Klebsiella pneumoniae عند 10.9 ng/µL يدويًا و1.9 ng/µL بعد الأتمتة. وبعد التسلسل والتسوية إلى مليون قراءة لكل مكتبة، كانت مقاييس التجميع متشابهة. ومن بين السلالات الأربع عشرة التي توفر لها مخطط cgMLST خاص بالنوع، تطابقت الأنماط المعقدة بنسبة 100%؛ أما السلالتان المتبقيتان فلم يتوفر لهما مخطط قابل للتطبيق (Meijers et al., 2024).

للدفعات المكونة من ثماني عينات في تلك التهيئة، بلغ وقت العمل اليدوي 25 دقيقة لسير العمل المؤتمت و125 دقيقة لسير العمل اليدوي. وبلغ زمن الإنجاز 170 و200 دقيقة على التوالي. وهذا انخفاض قدره 80% في وقت العمل اليدوي، لكنه انخفاض قدره 15% في إجمالي زمن الإنجاز ضمن إعداد تلك الدراسة — وليس تسريعًا عالميًا بمقدار خمسة أضعاف لتحضير مكتبات NGS (Meijers et al., 2024).

mRNA-seq: ‏NEBNext Ultra II Directional RNA على Biomek i7

قارن Santacruz وزملاؤه المكتبات اليدوية والمؤتمتة من 84 عينة RNA مشتقة من خطين خلويين بشريين، باستخدام طقم NEBNext Ultra II Directional RNA وجهاز Biomek i7. وأبلغوا عن ملفات تعبير مترابطة ترابطًا وثيقًا. استبدلت الطريقة المؤتمتة بروتوكولًا يدويًا مدته يومان ونحو 12 ساعة بتشغيل للجهاز دون تدخل يدوي مدته تسع ساعات بعد نحو ساعتين من تحضير الكواشف. وتنطبق هذه النتائج على إدخال RNA البالغ 250 ng، وعينات الخطوط الخلوية، والطقم، ومحطة العمل في الدراسة؛ ولا تثبت الأداء للعينات المتدهورة أو منخفضة الإدخال أو السريرية أو غيرها من عينات RNA (Santacruz et al., 2022؛ 2024 corrigendum).

استكشف الأعطال انطلاقًا من الملاحظات، لا من سبب واحد مفترض

قد ينتج العرض نفسه عن أكثر من عامل. غيّر معلمة مبررة واحدة في كل مرة، واحتفظ بأدلة التشغيل الفاشل، وكرر المقارنة ذات الصلة بدل إعلان أن «الأتمتة لا تعمل». وتظل المعايرة والصيانة الروتينيتان، وكفاءة العاملين، ومراقبة QC، وعملية مضبوطة لتغييرات النصوص البرمجية ضرورية بعد الإطلاق الأولي (Socea et al., 2023).

روابط الأجهزة: قيّم الطريقة، لا حجم سطح العمل وحده

تدرج صفحة تطبيق تحضير مكتبات NGS في Pize ثلاثة أنظمة مؤتمتة ذات صلة لتحضير العينات. تلخص الأوصاف أدناه كتالوج Pize الحالي؛ وهي ليست بيانات تحقق مستقلة ولا تثبت التوافق مع طقم بعينه.

لا تفسر «30 موضعًا» على أنها «30 عينة»، ولا تعامل الوحدات الاختيارية على أنها قياسية، ولا تحوّل عبارة تنقية الخرز لـ384 عينة في iLab-300R إلى ادعاء بتحضير مكتبات NGS لـ384 عينة. اطلب إصدار النص البرمجي الدقيق، وخريطة سطح العمل، وقائمة الأدوات المخبرية، ونطاق الإدخال المتحقق منه، وبيانات QC، والخطوات اليدوية المتبقية، وترتيبات الدعم، وعملية إدارة التغيير. تفيد صفحة كتالوج AMTK الأوسع في التصفح، لكن إدراجًا في كتالوج لا يثبت شراكة أو وضعًا تنظيميًا أو ملاءمة لمختبر بعينه.

بعد التسلسل: افصل بين التحقق من العمل المخبري الرطب والتحليل

Pize هو مساعد برمجة بالذكاء الاصطناعي للحوسبة العلمية والتحليل الإحصائي. يعمل في Pize Code وPositron، ويتوفر أيضًا في صورة SDK. وهذا الدور البرمجي منفصل عن طريقة جهاز مناولة السوائل؛ فلا ينبغي وصف Pize بأنه يتحكم في الأجهزة المذكورة أعلاه أو يؤهلها أو يدمجها. ويجب توثيق أي سير عمل تحليلي لاحق والتحقق منه لاستخدامه المقصود، مثلما هو الحال مع سير العمل المخبري الرطب.

الأسئلة الشائعة

كم عدد العينات الذي يجعل الأتمتة مجدية؟

لا يوجد حد عالمي. قارن وقت العمل اليدوي الحالي، وتواتر الدفعات، ومعدل الإعادة، وقيود الكوادر، واستخدام الكواشف والمستهلكات، والصيانة، واستغلال الجهاز، وجهد التحقق. قد يقدّر مختبر منخفض الحجم الدفعات الصغيرة السريعة، بينما قد يعطي مختبر مرتفع الحجم الأولوية للسعة. ويعتمد التوازن المناسب على سير العمل (Socea et al., 2023).

هل يمكن أتمتة طقم Illumina أو NEB مباشرة؟

فقط عندما توجد طريقة للطقم والإصدار وتهيئة الجهاز والأدوات والوحدات المحددة بالضبط، أو عندما يطور المختبر مثل هذه الطريقة ويتحقق منها. البروتوكول الناجح على روبوت واحد دليل على ذلك التنفيذ، وليس ضمانًا قابلًا للنقل إلى منصة أخرى (Hess et al., 2020).

كم ينبغي أن يستغرق التحقق؟

لا توجد مدة ثابتة سليمة علميًا تنطبق على كل مختبر. يعتمد الزمن على الاستخدام المقصود، والعبء التنظيمي، وتنوع العينات، ومعايير القبول، وتوافر مواد مقترنة، وعدد ظروف الدقة، وتحقيقات الفشل، وما إذا كانت الطريقة أو الأجهزة تتغير أثناء الدراسة (Socea et al., 2023).

هل ينبغي أن يكون مردود المكتبات المؤتمتة واليدوية متطابقًا؟

ليس بالضرورة. السؤال هو ما إذا كانت الفروق المحددة مسبقًا مقبولة عبر QC للمكتبة، وQC للتسلسل، ونقطة النهاية الخاصة بالاختبار. أبلغت دراسة Meijers عن نتائج متقاربة عمومًا، لكنها أظهرت أيضًا قيمة تركيز شاذة واضحة؛ لذلك تكون المقارنة على مستوى نقطة النهاية أكثر إفادة من ادعاء تطابق المردود (Meijers et al., 2024).

هل يعني «التشغيل دون تدخل» عدم وجود عمل بشري؟

لا. قد يظل الإعداد وتحضير الكواشف والتحميل والنقل خارج سطح العمل وQC والاسترداد والمراجعة يدويًا. ففي الدراستين المذكورتين أعلاه، تطلبت طريقة flowbot ONE معالجة PCR خارج سطح العمل وإضافة الفهارس يدويًا، بينما تطلبت طريقة Biomek i7 نحو ساعتين لتحضير الكواشف قبل تشغيل الجهاز تسع ساعات (Meijers et al., 2024؛ Santacruz et al., 2022).

المراجع

1. Head SR, Komori HK, LaMere SA, Whisenant T, Van Nieuwerburgh F, Salomon DR, Ordoukhanian P. Library construction for next-generation sequencing: overviews and challenges. BioTechniques. 2014;56(2):61–77. doi:10.2144/000114133.
2. Hess JF, Kohl TA, Kotrová M, Rönsch K, Paprotka T, Mohr V, Hutzenlaub T, Brüggemann M, Zengerle R, Niemann S, Paust N. Library preparation for next generation sequencing: A review of automation strategies. Biotechnology Advances. 2020;41:107537. doi:10.1016/j.biotechadv.2020.107537.
3. Socea JN, Stone VN, Qian X, Gibbs PL, Levinson KJ. Implementing laboratory automation for next-generation sequencing: benefits and challenges for library preparation. Frontiers in Public Health. 2023;11:1195581. doi:10.3389/fpubh.2023.1195581.
4. Meijers E, Verhees FB, Heemskerk D, Wessels E, Claas ECJ, Boers SA. Automating the Illumina DNA library preparation kit for whole genome sequencing applications on the flowbot ONE liquid handler robot. Scientific Reports. 2024;14:8159. doi:10.1038/s41598-024-58963-2.
5. Santacruz D, Enane FO, Fundel-Clemens K, Giner M, Wolf G, Onstein S, Klimek C, Smith Z, Wijayawardena B, Viollet C. Automation of high-throughput mRNA-seq library preparation: a robust, hands-free and time efficient methodology. SLAS Discovery. 2022;27(2):140–147. doi:10.1016/j.slasd.2022.01.002.
6. Santacruz D, et al. Corrigendum to “Automation of high-throughput mRNA-seq library preparation: a robust, hands-free and time efficient methodology.” SLAS Discovery. 2024;29(5):100169. doi:10.1016/j.slasd.2024.100169.
7. DeAngelis MM, Wang DG, Hawkins TL. Solid-phase reversible immobilization for the isolation of PCR products. Nucleic Acids Research. 1995;23(22):4742–4743. doi:10.1093/nar/23.22.4742.
8. Illumina. Illumina DNA Prep Reference Guide. Document 1000000025416 v12. 2026. وثائق المنتج الرسمية.
9. Illumina. Adapter dimers: causes, effects, and how to remove them. Knowledge Article #1911. مقالة المعرفة الرسمية.

ملاحظة ترخيص الأشكال

أُعيد إنتاج الشكلين 1 و2 من Meijers et al.، Scientific Reports 14، 8159 (2024)، بموجب رخصة المشاع الإبداعي نَسب المُصنَّف 4.0 الدولية (CC BY 4.0). لم تُغيّر الصور باستثناء تحجيم العرض. ولا يعني إدراجها تأييدًا من المؤلفين أو Flow Robotics أو Illumina أو Springer Nature أو أي جهة أخرى مذكورة.