Cara Mengotomatiskan Preparasi Pustaka NGS: Dari Protokol Manual hingga Alur Kerja Tervalidasi

Preparasi pustaka NGS mengubah DNA atau RNA menjadi pustaka yang kompatibel dengan platform sekuensing. Bergantung pada jenis pengujiannya, pekerjaan ini dapat mencakup fragmentasi atau seleksi ukuran, konversi menjadi DNA untai ganda, penambahan adapter, amplifikasi, pembersihan, dan kuantifikasi akhir. Kualitas pustaka dapat memengaruhi kompleksitas, bias, efek batch, serta kegunaan data sekuens yang dihasilkan (Head et al., 2014).

Otomatisasi dapat menstandarkan penanganan cairan yang berulang dan mengurangi pekerjaan langsung oleh operator, tetapi suatu protokol tidak otomatis menjadi valid hanya karena robot dapat menjalankannya. Kimia, konfigurasi instrumen, labware, metode perangkat lunak, jenis sampel, dan tujuan penggunaan membentuk satu implementasi yang harus dievaluasi secara terpadu. Karena itu, tinjauan mengenai otomatisasi NGS menekankan peluang untuk mengurangi hambatan proses bertahap sekaligus perlunya menyesuaikan strategi otomatisasi dengan throughput, fleksibilitas, akses terhadap kendali mutu, kebutuhan personel, dan biaya (Hess et al., 2020; Socea et al., 2023).

Ruang lingkup. Artikel ini merupakan panduan implementasi dan validasi, bukan prosedur operasi standar khusus kit. Ikuti petunjuk terkini untuk kit preparasi pustaka dan instrumen yang Anda gunakan. Penggunaan klinis atau diagnostik juga memerlukan validasi sesuai ketentuan yang berlaku di laboratorium Anda.

Migrasi dalam lima bagian

1. Tetapkan tujuan penggunaan dan batas otomatisasi.
2. Terjemahkan metode manual yang berlaku menjadi instruksi mesin yang eksplisit.
3. Kembangkan operasi penanganan cairan dan manik magnetik pada deck yang dipilih.
4. Bandingkan metode otomatis dengan metode manual yang diterima dan uji presisinya.
5. Rilis metode hanya setelah kriteria penerimaan, kontrol, pemeliharaan, dan pengendalian perubahan didokumentasikan.

Tidak ada ukuran batch minimum, durasi validasi tetap, atau jumlah reaksi tambahan standar yang berlaku secara universal untuk memastikan keberhasilan langkah-langkah tersebut. Nilainya bergantung pada pengujian, risiko, instrumen, model biaya, dan persyaratan laboratorium (Socea et al., 2023).

1. Tetapkan apa yang akan—dan tidak akan—dikerjakan instrumen

Mulailah dengan versi kit yang tepat, jenis sampel, rentang input, ukuran batch yang diinginkan, platform sekuensing, dan hasil yang harus didukung alur kerja. Selanjutnya, tentukan operasi mana yang tetap dijalankan pada liquid handler dan operasi mana yang memerlukan instrumen off-deck atau pemindahan oleh operator. Otomatisasi NGS bukanlah satu arsitektur tunggal: setiap workstation dapat berbeda dalam kepala pipet, magnet, gripper, shaker, pengendali suhu, thermal cycler, reader, kapasitas deck, dan fleksibilitas perangkat lunak (Hess et al., 2020; Socea et al., 2023).

Jangan menyebut PCR atau QC sebagai proses yang secara inheren “manual”. Pada sebagian sistem proses tersebut diotomatisasi, sedangkan pada sistem lain dilakukan secara off-deck. Demikian pula, instrumen yang memiliki modul opsional tidak boleh disebut mempunyai fungsi tersebut kecuali modul itu benar-benar terpasang dan telah dikualifikasi.

2. Terjemahkan protokol manual menjadi metode yang dapat dibaca mesin

Protokol manual sering menyembunyikan keputusan di balik frasa seperti “campur secara menyeluruh”, “tunggu hingga jernih”, atau “hindari mengganggu pelet”. Metode mesin harus mengganti pertimbangan tersebut dengan parameter yang eksplisit dan dapat diuji. Catat sekurang-kurangnya hal-hal berikut pada setiap langkah:

• nama reagen, persyaratan yang sensitif terhadap lot, kondisi penyimpanan, dan volume kerja;
• labware sumber dan tujuan, geometri sumur, dan orientasi pelat;
• volume, ketinggian, dan kecepatan aspirasi serta dispensing, jeda, dan pre-wetting tip jika relevan;
• volume, kecepatan, dan jumlah siklus pencampuran, serta kemungkinan manik mengendap saat pelat menunggu;
• setpoint inkubasi, suhu sampel terverifikasi, durasi, tutup atau seal, dan waktu pemindahan;
• jenis magnet, kompatibilitas pelat, endpoint pemisahan, lokasi pelet, dan jalur aspirasi;
• kebijakan tip, pemisahan pra- dan pasca-PCR, serta pengendalian kontaminasi;
• setiap intervensi manual, titik henti aman, tindakan pemulihan, dan field log audit.

Petunjuk produsen merupakan batasan awal, bukan detail yang baru ditambahkan kemudian. Sebagai contoh, dokumentasi Illumina DNA Prep terkini menginstruksikan pengguna untuk membawa purification beads ke suhu ruang, melakukan vortex agar manik tersuspensi kembali, mengaspirasi dan mendispensing suspensi kental secara perlahan, menunggu cairan menjadi jernih di atas magnet, membuang sisa etanol, serta mengikuti tahap pengeringan dan resuspensi yang ditetapkan (Illumina DNA Prep, document 1000000025416 v12). Metode otomatis harus mereproduksi tujuan operasi tersebut tanpa berasumsi bahwa gerakan manual dapat langsung dipindahkan ke robot.

Ukur volume berlebih, jangan menyalin aturan praktis

Volume reagen berlebih harus mencakup sisa volume yang masih dapat diaspirasi dari reservoir terpilih, perilaku pemipetan, dan kehilangan dalam alur kerja aktual. Nilai ini tidak dapat ditentukan dengan aman menggunakan jumlah reaksi tambahan tetap yang berlaku universal. Meijers dan kolega menggunakan kelebihan reagen setara dengan empat sampel dalam metode otomatis delapan sampel mereka, sedangkan protokol manual Illumina DNA Prep menentukan kelebihan 20% saat menyiapkan etanol untuk tahap pembersihan. Keduanya merupakan contoh yang spesifik terhadap implementasi, bukan nilai standar umum (Meijers et al., 2024; Illumina DNA Prep v12).

3. Perlakukan operasi manik magnetik sebagai proses terkendali

Solid-phase reversible immobilization (SPRI) pada awalnya dijelaskan sebagai pengikatan DNA yang bersifat reversibel pada partikel magnetik berkarboksil dalam keberadaan polietilena glikol dan garam, menggunakan metode pemurnian produk PCR format 96 sumur yang dirancang agar kompatibel dengan otomatisasi (DeAngelis et al., 1995). Makalah dasar tersebut tidak menetapkan rasio manik universal, ambang ukuran fragmen, waktu pengeringan, atau aturan penghilangan adapter dimer untuk kit NGS modern.

Untuk kit yang benar-benar digunakan, kembangkan dan verifikasi:

• cara mengembalikan manik ke suspensi seragam sebelum dan selama dispensing;
• rasio manik terhadap sampel dan urutan penambahan yang ditentukan metode;
• pencampuran yang menghasilkan recovery memadai tanpa pembentukan busa atau aerosol berlebihan;
• waktu pemisahan dan kriteria untuk memutuskan bahwa supernatan sudah jernih;
• ketinggian dan jalur aspirasi yang menghilangkan supernatan tanpa mengambil pelet;
• pembuangan menyeluruh sisa larutan pencuci tanpa membuat manik terlalu kering;
• elusi dan resuspensi sempurna sebelum pemindahan berikutnya.

Variabel-variabel tersebut saling berinteraksi. Sebagai contoh, hasil pustaka yang rendah dapat disebabkan oleh kualitas input, kinerja enzim, kehilangan saat pemindahan, sisa etanol, pengeringan berlebih, atau elusi tidak lengkap, bukan oleh satu “masalah manik” yang universal. Illumina secara khusus memperingatkan bahwa sisa etanol dapat memengaruhi kinerja pengujian dan bahwa pelet manik tidak boleh terlalu kering atau terganggu selama tahap pencucian (Illumina DNA Prep v12).

Adapter dimer juga memiliki beberapa kemungkinan penyebab. Adapter dimer mengandung sekuens adapter lengkap tanpa insert yang dimaksud dan dapat menghabiskan reads sekuensing karena membentuk cluster pada flow cell. Illumina mencantumkan input yang rendah atau berkualitas buruk serta pembersihan manik yang tidak efisien sebagai penyebab, dan menjelaskan puncak tak terduga sekitar 120–170 bp sebagai salah satu tanda yang umum. Namun, tindakan korektif tetap harus mengikuti kit pustaka dan platform sekuensing yang digunakan (Illumina Knowledge Article #1911).

4. Rancang validasi sebelum menjalankan perbandingan

Tetapkan kriteria penerimaan sebelum melihat hasil otomatis. Desain studi harus mencerminkan jenis sampel dan hasil yang dituju, bukan checklist tetap dari internet. Socea dan kolega membedakan akurasi, repeatability, reproducibility, sensitivitas dan spesifisitas analitis, perbandingan metode, serta endpoint yang dapat dilaporkan. Mereka juga menyatakan bahwa jumlah sampel untuk presisi harus ditentukan dan disetujui dalam kerangka validasi masing-masing laboratorium (Socea et al., 2023).

Perbandingan yang dapat dipertanggungjawabkan biasanya meliputi:

1. Perbandingan metode. Siapkan bahan yang sepadan menggunakan metode manual yang diterima dan metode otomatis kandidat. Selaraskan bahan input, lot reagen, dan kondisi sekuensing hilir bila memungkinkan.
2. Repeatability. Ulangi sampel dalam satu run untuk mengukur variasi pada kondisi yang sama.
3. Reproducibility. Lakukan pengulangan pada hari, operator, instrumen, lot reagen, atau runs yang relevan.
4. Rentang dan sampel tantangan. Wakili rentang input, matriks sampel, kondisi mutu, dan kondisi sulit yang benar-benar diizinkan dalam tujuan penggunaan.
5. Kontrol kontaminasi. Tempatkan kontrol negatif dan positif yang informatif agar carryover dan pertukaran sampel dapat dideteksi.
6. Penanganan kegagalan. Uji interupsi, modul yang tidak tersedia, volume tidak cukup, kegagalan QC, serta prosedur pemulihan atau penghentian aman yang telah disetujui.

Pilih metrik yang menghubungkan pustaka dengan hasil akhir

Tidak ada satu metrik pun yang membuktikan ekuivalensi. Konsentrasi pustaka dapat terlihat memadai sementara distribusi fragmen, kontaminasi, cakupan, atau endpoint khusus pengujian tetap gagal. Head dan kolega membahas bagaimana konstruksi pustaka dapat menimbulkan bias, mengurangi kompleksitas, dan menghasilkan efek batch, sedangkan Socea dan kolega menunjukkan pentingnya memilih checkpoint QC dan kriteria khusus hasil sesuai tujuan pengujian (Head et al., 2014; Socea et al., 2023).

Hal yang ditunjukkan—dan tidak ditunjukkan—oleh perbandingan yang dipublikasikan

Studi yang dipublikasikan merupakan contoh desain penelitian yang bermanfaat, tetapi bukan pengganti validasi untuk kit, instrumen, jenis sampel, atau hasil yang berbeda.

Sekuensing genom utuh bakteri: Illumina DNA Prep pada flowbot ONE

Meijers dan kolega menyiapkan 16 ekstrak DNA bakteri dengan alur kerja Illumina DNA Prep manual dan otomatis. Delapan ekstrak tersebut diproses kembali dalam run otomatis yang independen. Metode otomatis menggunakan deck flowbot ONE tertentu dengan perangkat keras untuk pemipetan, pemanasan/pendinginan, dan magnetik; strip tabung PCR dipindahkan ke thermal cycler off-deck dan index ditambahkan secara manual (Meijers et al., 2024).

Studi tersebut melaporkan perbedaan median 1.5 kali dalam konsentrasi DNA pustaka antara metode manual dan otomatis, tetapi nilainya tidak identik: satu pustaka Klebsiella pneumoniae memiliki konsentrasi 10.9 ng/µL saat disiapkan secara manual dan 1.9 ng/µL setelah otomatisasi. Setelah sekuensing dan normalisasi menjadi satu juta reads per pustaka, metrik assembly serupa. Di antara 14 strain yang memiliki cgMLST scheme khusus spesies, complex type menunjukkan kesesuaian 100%; dua strain lainnya tidak memiliki scheme yang dapat diterapkan (Meijers et al., 2024).

Untuk batch berisi delapan sampel pada konfigurasi tersebut, waktu hands-on adalah 25 menit untuk alur kerja otomatis dan 125 menit untuk alur kerja manual. Turnaround time masing-masing adalah 170 dan 200 menit. Hal ini menunjukkan pengurangan waktu hands-on sebesar 80%, tetapi hanya pengurangan turnaround time total sebesar 15% pada konfigurasi studi tersebut—bukan percepatan universal lima kali lipat untuk preparasi pustaka NGS (Meijers et al., 2024).

mRNA-seq: NEBNext Ultra II Directional RNA pada Biomek i7

Santacruz dan kolega membandingkan pustaka manual dan otomatis dari 84 sampel RNA yang berasal dari dua lini sel manusia, menggunakan kit NEBNext Ultra II Directional RNA dan Biomek i7. Mereka melaporkan profil ekspresi yang berkorelasi erat. Metode otomatis menggantikan protokol manual sekitar 12 jam yang berlangsung selama dua hari dengan run instrumen hands-free selama sembilan jam setelah sekitar dua jam persiapan reagen. Hasil tersebut berlaku untuk input RNA 250 ng, sampel lini sel, kit, dan workstation dalam studi tersebut; hasilnya tidak menetapkan kinerja untuk sampel RNA terdegradasi, input rendah, klinis, atau jenis lainnya (Santacruz et al., 2022; 2024 corrigendum).

Lakukan troubleshooting berdasarkan pengamatan, bukan satu penyebab yang diasumsikan

Lebih dari satu faktor dapat menghasilkan gejala yang sama. Ubah satu parameter yang memiliki dasar pada satu waktu, simpan bukti run yang gagal, dan ulangi perbandingan terkait, alih-alih menyatakan bahwa “otomatisasi tidak berfungsi”. Kalibrasi rutin, pemeliharaan, kompetensi staf, pemantauan QC, dan proses terkendali untuk perubahan skrip tetap diperlukan setelah rilis awal (Socea et al., 2023).

Tautan instrumen: evaluasi metodenya, bukan hanya ukuran deck

Halaman aplikasi preparasi pustaka NGS Pize mencantumkan tiga sistem preparasi sampel otomatis terkait. Uraian di bawah merangkum katalog Pize saat ini; uraian ini bukan data validasi independen dan tidak menetapkan kompatibilitas dengan kit tertentu.

Jangan menafsirkan “30 posisi” sebagai “30 sampel”, menganggap modul opsional sebagai kelengkapan standar, atau mengubah pernyataan pemurnian manik 384 sampel pada iLab-300R menjadi klaim preparasi pustaka NGS untuk 384 sampel. Mintalah versi skrip, peta deck, daftar labware, rentang input tervalidasi, data QC, tahap manual yang tersisa, pengaturan dukungan, dan proses pengendalian perubahan secara tepat. Halaman katalog AMTK yang lebih luas berguna untuk penelusuran, tetapi pencantuman dalam katalog tidak membuktikan kemitraan, status regulasi, atau kesesuaian bagi laboratorium tertentu.

Setelah sekuensing: pisahkan validasi wet-lab dan analisis

Pize adalah asisten coding AI untuk komputasi ilmiah dan analisis statistik. Pize berjalan di Pize Code dan Positron, serta tersedia sebagai SDK. Peran perangkat lunak ini terpisah dari metode liquid handler: Pize tidak boleh digambarkan sebagai pengendali, pengualifikasi, atau pengintegrasi instrumen yang tercantum di atas. Setiap alur kerja analisis hilir harus didokumentasikan dan divalidasi sesuai tujuan penggunaannya sendiri, sebagaimana alur kerja wet-lab.

Pertanyaan yang sering diajukan

Berapa jumlah sampel yang membuat otomatisasi layak dilakukan?

Tidak ada ambang universal. Bandingkan waktu hands-on saat ini, frekuensi batch, tingkat pengulangan, keterbatasan personel, penggunaan reagen dan bahan sekali pakai, pemeliharaan, pemanfaatan instrumen, dan upaya validasi. Laboratorium bervolume rendah mungkin menghargai batch kecil yang cepat; laboratorium bervolume tinggi mungkin memprioritaskan kapasitas. Keseimbangan yang tepat bergantung pada alur kerja (Socea et al., 2023).

Apakah kit Illumina atau NEB dapat langsung diotomatisasi?

Hanya jika tersedia metode untuk kit dan versi, konfigurasi instrumen, labware, serta modul yang tepat—atau laboratorium mengembangkan dan memvalidasi metode tersebut. Protokol yang berhasil pada satu robot merupakan bukti untuk implementasi itu, bukan jaminan yang dapat langsung dipindahkan ke platform lain (Hess et al., 2020).

Berapa lama validasi harus berlangsung?

Tidak ada durasi tetap yang dapat dipertanggungjawabkan secara ilmiah untuk setiap laboratorium. Waktunya bergantung pada tujuan penggunaan, beban regulasi, keragaman sampel, kriteria penerimaan, ketersediaan bahan berpasangan, jumlah kondisi presisi, penyelidikan kegagalan, dan apakah metode atau perangkat keras berubah selama studi (Socea et al., 2023).

Apakah pustaka otomatis dan manual harus mempunyai yield yang identik?

Tidak selalu. Pertanyaannya adalah apakah perbedaan yang telah ditetapkan sebelumnya dapat diterima dalam QC pustaka, QC sekuensing, dan endpoint khusus pengujian. Studi Meijers melaporkan hasil yang secara umum sebanding, tetapi juga satu outlier konsentrasi yang jelas. Karena itu, perbandingan pada tingkat endpoint lebih informatif daripada menyatakan bahwa yield identik (Meijers et al., 2024).

Apakah “walk-away” berarti tidak ada pekerjaan oleh operator?

Tidak. Penyiapan, persiapan reagen, pemuatan, pemindahan off-deck, QC, pemulihan, dan peninjauan dapat tetap dilakukan secara manual. Dalam kedua studi yang dibahas di atas, metode flowbot ONE memerlukan penanganan PCR off-deck dan penambahan index secara manual, sedangkan metode Biomek i7 membutuhkan persiapan reagen sekitar dua jam sebelum run instrumen selama sembilan jam (Meijers et al., 2024; Santacruz et al., 2022).

Referensi

1. Head SR, Komori HK, LaMere SA, Whisenant T, Van Nieuwerburgh F, Salomon DR, Ordoukhanian P. Library construction for next-generation sequencing: overviews and challenges. BioTechniques. 2014;56(2):61–77. doi:10.2144/000114133.
2. Hess JF, Kohl TA, Kotrová M, Rönsch K, Paprotka T, Mohr V, Hutzenlaub T, Brüggemann M, Zengerle R, Niemann S, Paust N. Library preparation for next generation sequencing: A review of automation strategies. Biotechnology Advances. 2020;41:107537. doi:10.1016/j.biotechadv.2020.107537.
3. Socea JN, Stone VN, Qian X, Gibbs PL, Levinson KJ. Implementing laboratory automation for next-generation sequencing: benefits and challenges for library preparation. Frontiers in Public Health. 2023;11:1195581. doi:10.3389/fpubh.2023.1195581.
4. Meijers E, Verhees FB, Heemskerk D, Wessels E, Claas ECJ, Boers SA. Automating the Illumina DNA library preparation kit for whole genome sequencing applications on the flowbot ONE liquid handler robot. Scientific Reports. 2024;14:8159. doi:10.1038/s41598-024-58963-2.
5. Santacruz D, Enane FO, Fundel-Clemens K, Giner M, Wolf G, Onstein S, Klimek C, Smith Z, Wijayawardena B, Viollet C. Automation of high-throughput mRNA-seq library preparation: a robust, hands-free and time efficient methodology. SLAS Discovery. 2022;27(2):140–147. doi:10.1016/j.slasd.2022.01.002.
6. Santacruz D, et al. Corrigendum to “Automation of high-throughput mRNA-seq library preparation: a robust, hands-free and time efficient methodology.” SLAS Discovery. 2024;29(5):100169. doi:10.1016/j.slasd.2024.100169.
7. DeAngelis MM, Wang DG, Hawkins TL. Solid-phase reversible immobilization for the isolation of PCR products. Nucleic Acids Research. 1995;23(22):4742–4743. doi:10.1093/nar/23.22.4742.
8. Illumina. Illumina DNA Prep Reference Guide. Document 1000000025416 v12. 2026. Dokumentasi produk resmi.
9. Illumina. Adapter dimers: causes, effects, and how to remove them. Knowledge Article #1911. Artikel pengetahuan resmi.

Catatan lisensi gambar

Gambar 1 dan 2 direproduksi dari Meijers et al., Scientific Reports 14, 8159 (2024), berdasarkan Creative Commons Attribution 4.0 International License. Gambar tidak diubah selain penskalaan tampilan. Penyertaannya tidak menyiratkan dukungan dari penulis, Flow Robotics, Illumina, Springer Nature, atau organisasi lain yang disebutkan.