如何实现 NGS 文库制备自动化：从手工方案到经过验证的工作流程

NGS 文库制备将 DNA 或 RNA 转化为与测序平台兼容的文库。根据检测方法的不同，这一过程可能包括片段化或片段大小选择、转化为双链 DNA、接头连接、扩增、纯化以及最终定量。文库质量会影响复杂度、偏倚、批次效应，以及最终序列数据的可用性（Head et al., 2014）。

自动化能够规范重复性的液体处理操作并减少人工操作时间，但并不意味着只要机器人可以执行某项方案，该方案就自然有效。化学体系、仪器配置、实验室耗材、软件方法、样本类型和预期用途共同构成一个必须整体评估的具体实现。因此，NGS 自动化综述既强调其缓解多步骤瓶颈的潜力，也强调自动化策略必须与通量、灵活性、质量控制的可达性、人员配置和成本相匹配（Hess et al., 2020；Socea et al., 2023）。

适用范围。 本文是一份实施与验证指南，不是针对某一试剂盒的标准操作程序。请遵循与你所使用的具体文库制备试剂盒和仪器相对应的最新说明。临床或诊断用途还必须按照实验室适用的法规和规范完成验证。

迁移工作的五个组成部分

1. 明确预期用途和自动化边界。
2. 将现有手工方法转化为明确的机器指令。
3. 在选定的工作台面上开发液体处理和磁珠操作。
4. 将自动化方法与已接受的手工方法进行比较，并检验精密度。
5. 只有在验收标准、对照、维护和变更控制均形成文档后，才发布该方法。

不存在适用于所有情况的最小批量、固定验证周期或额外反应默认数量。这些数值取决于检测方法、风险、仪器、成本模型和实验室要求（Socea et al., 2023）。

1. 明确仪器要做什么——以及不做什么

首先明确试剂盒的准确版本、样本类型、输入范围、目标批量、测序平台，以及工作流程必须支持的结果。随后决定哪些操作保留在液体处理工作站上，哪些需要台外仪器或人工转移。NGS 自动化并非单一架构：不同工作站的移液头、磁力模块、机械臂、振荡器、温控装置、热循环仪、读板仪、台面容量和软件灵活性均有差异（Hess et al., 2020；Socea et al., 2023）。

不要将 PCR 或 QC 一概称为“手工”操作。有些系统能够将其自动化，另一些系统则在台外完成。同样，除非可选模块已经实际安装并通过确认，否则不应把带有该可选模块的仪器描述为具备相应功能。

2. 将手工方案转化为机器可读的方法

手工方案往往把判断隐藏在“充分混匀”“等待液体澄清”或“避免扰动磁珠沉淀”等表述中。机器方法必须用明确且可检验的参数取代这些主观判断。每个步骤至少应记录以下内容：

• 试剂名称、对批次敏感的要求、储存条件和工作体积；
• 来源和目标耗材、孔形和板方向；
• 吸液和排液体积、高度、速度、延时，以及适用时的吸头预润湿；
• 混匀体积、速度、循环次数，以及板等待时磁珠是否会沉降；
• 孵育设定温度、经验证的样本温度、时长、盖板或封膜以及转移时间；
• 磁力模块类型、板兼容性、分离终点、磁珠沉淀位置和吸液路径；
• 吸头策略、PCR 前后区域分隔和污染控制；
• 每项人工干预、安全停止点、恢复操作和审计日志字段。

生产商说明是设计起点的约束条件，而不是日后再补上的细节。例如，当前 Illumina DNA Prep 文档要求使用者将纯化磁珠恢复至室温、涡旋重悬，以较慢速度吸取和排出黏稠的磁珠悬液，在磁力架上等待液体澄清，去除残余乙醇，并按规定完成干燥和重悬步骤（Illumina DNA Prep, document 1000000025416 v12）。自动化方法必须实现这些操作的目的，而不能假定手工动作可以原样移植到机器人上。

测量过量配制，而不是照搬经验法则

试剂过量配制必须覆盖所选储液槽中可吸取液体的残余体积、实际移液行为以及工作流程中的损失。不能用通用的固定额外反应数来安全定义。Meijers 及其同事在其特定的 8 样本自动化方法中，采用了相当于 4 个样本用量的试剂余量；Illumina DNA Prep 手工方案则规定，在配制纯化步骤所用乙醇时增加 20% 的余量。两者都是针对具体实现的示例，而不是通用默认值（Meijers et al., 2024；Illumina DNA Prep v12）。

3. 将磁珠操作作为受控过程管理

固相可逆固定化（SPRI）最初被描述为：在聚乙二醇和盐存在的条件下，DNA 可逆结合至羧基化磁性颗粒；该方法采用适合自动化的 96 孔 PCR 产物纯化形式（DeAngelis et al., 1995）。这篇奠基性论文并未为现代 NGS 试剂盒确立通用磁珠比例、片段大小截点、干燥时间或接头二聚体去除规则。

针对实际使用的试剂盒，应开发并验证以下内容：

• 分配前及分配过程中，如何使磁珠恢复并维持均一悬浮；
• 方法规定的磁珠与样本比例及加入顺序；
• 能够保证回收率、同时避免过度起泡或产生气溶胶的混匀方式；
• 分离时间，以及用于判断上清液已澄清的标准；
• 能够移除上清液而不吸入磁珠沉淀的吸液高度和路径；
• 在不过度干燥磁珠的前提下彻底去除残余洗液；
• 下一次转移前实现完全洗脱和重悬。

这些变量彼此影响。例如，文库产量低可能源于输入质量、酶性能、转移损失、残余乙醇、过度干燥或洗脱不完全，而不一定是某个通用的“磁珠问题”。Illumina 特别警告，残余乙醇可能影响检测表现，且在洗涤步骤中不应过度干燥或扰动磁珠沉淀（Illumina DNA Prep v12）。

接头二聚体也可能由多种原因造成。它们含有完整接头序列但不含目标插入片段，并且由于可以在流动槽上形成簇而占用测序 reads。Illumina 将输入量过低、输入质量不佳和磁珠纯化效率低列为成因，并将约 120–170 bp 的异常小峰描述为常见迹象；具体纠正措施仍须遵循实际文库试剂盒和测序平台的要求（Illumina Knowledge Article #1911）。

4. 在开展比较之前设计验证方案

在查看自动化结果之前就应定义验收标准。研究设计应反映预期样本类型和目标结果，而不是照搬网络上的固定清单。Socea 及其同事区分了准确度、重复性、再现性、分析灵敏度和特异性、方法比较以及可报告终点；他们同时指出，用于精密度评估的样本数应在各实验室自身的验证框架内确定并获得批准（Socea et al., 2023）。

一项具有充分依据的比较通常包括：

1. 方法比较。 使用匹配的材料分别执行已接受的手工方法和候选自动化方法。在可行情况下，使输入材料、试剂批次和下游测序条件保持一致。
2. 重复性。 在同一 run 内重复处理样本，以测量相同条件下的变异。
3. 再现性。 在相关日期、操作人员、仪器、试剂批次或 runs 之间进行重复。
4. 范围和挑战样本。 覆盖预期用途实际允许的输入范围、样本基质、质量状态和困难条件。
5. 污染对照。 合理放置阴性对照和具有辨识度的阳性对照，以便检出残留污染和样本错配。
6. 故障处理。 测试中断、模块不可用、体积不足、QC 失败，以及任何获批的恢复操作或安全停止程序。

选择能够把文库与最终结果联系起来的指标

任何单一指标都不能证明等效性。文库浓度可能看似合格，但片段分布、污染、覆盖度或检测特异性终点仍可能失败。Head 及其同事讨论了文库构建如何引入偏倚、降低复杂度和产生批次效应；Socea 及其同事则说明了为什么必须根据预期检测选择 QC 检查点和结果特异性标准（Head et al., 2014；Socea et al., 2023）。

已发表的比较研究能说明什么——又不能说明什么

已发表研究可为研究设计提供有用示例，但不能替代针对不同试剂盒、仪器、样本类型或结果所开展的验证。

细菌全基因组测序：在 flowbot ONE 上运行 Illumina DNA Prep

Meijers 及其同事分别用手工和自动化 Illumina DNA Prep 工作流程处理了 16 份细菌 DNA 提取物。其中 8 份提取物又在一次独立的自动化 run 中重复处理。该自动化方法采用特定的 flowbot ONE 台面，配有移液、加热/冷却和磁力硬件；PCR 管条被转移至台外热循环仪，index 则由人工加入（Meijers et al., 2024）。

研究报告称，手工方法和自动化方法所得文库 DNA 浓度的中位差异为 1.5 倍，但数值并不完全相同：其中一个 Klebsiella pneumoniae 文库在手工制备后为 10.9 ng/µL，在自动化制备后为 1.9 ng/µL。测序并将每个文库归一化至 100 万 reads 后，组装指标相近。在 16 株细菌中，有 14 株存在适用的物种特异性 cgMLST scheme，其 complex type 达到 100% 一致；其余两株没有适用的 scheme（Meijers et al., 2024）。

在该配置下，以 8 个样本为一批时，自动化工作流程的人工操作时间为 25 分钟，手工工作流程为 125 分钟；周转时间分别为 170 分钟和 200 分钟。这表示该研究配置下人工操作时间减少了 80%，而总周转时间减少了 15%，并不代表 NGS 文库制备普遍提速 5 倍（Meijers et al., 2024）。

mRNA-seq：在 Biomek i7 上运行 NEBNext Ultra II Directional RNA

Santacruz 及其同事使用 NEBNext Ultra II Directional RNA 试剂盒和 Biomek i7，对来自两个人细胞系的 84 份 RNA 样本进行了手工文库与自动化文库比较，并报告表达谱高度相关。该自动化方法用约 2 小时完成试剂准备，随后进行 9 小时的无人值守仪器运行，取代了跨两天、约 12 小时的手工方案。这些结果仅适用于研究采用的 250 ng RNA 输入、细胞系样本、试剂盒和工作站，并不能证明其对降解、低输入、临床或其他 RNA 样本的表现（Santacruz et al., 2022；2024 corrigendum）。

根据观察结果排查问题，而不是预设唯一原因

多个因素可能产生相同症状。每次只更改一个有依据的参数，保留失败 run 的证据，并重复相关比较，而不是直接宣布“自动化不可行”。初次发布后，仍需要进行常规校准、维护、人员能力管理、QC 监控，并对脚本变更实施受控流程（Socea et al., 2023）。

仪器链接：评估方法，而不只是台面大小

Pize NGS 文库制备应用页面列出了三种相关的自动化样本制备系统。下方说明概述了当前 Pize 产品目录中的信息；它们不是独立验证数据，也不能证明与某一特定试剂盒兼容。

不要把“30 位”理解为“30 个样本”，不要把可选模块当作标准配置，也不要把 iLab-300R 的 384 样本磁珠纯化说明转化成 384 样本 NGS 文库制备的主张。应索取准确的脚本版本、台面图、耗材清单、经验证的输入范围、QC 数据、剩余手工步骤、支持安排和变更控制流程。更广泛的 AMTK 产品目录页面可用于浏览，但产品目录条目不能证明合作关系、监管状态或是否适合某个具体实验室。

测序之后：将湿实验验证与分析验证分开

Pize 是面向科学计算和统计分析的 AI 编程助手。它运行于 Pize Code 和 Positron，也以 SDK 形式提供。这一软件角色与液体处理工作站的方法彼此独立：不应将 Pize 描述为控制、确认或集成上述仪器。任何下游分析工作流程都必须根据其自身预期用途形成文档并完成验证，正如湿实验工作流程一样。

常见问题

多少个样本才值得采用自动化？

不存在通用阈值。应比较当前人工操作时间、批处理频率、重复率、人员限制、试剂和一次性耗材用量、维护、仪器利用率以及验证工作量。低通量实验室可能更重视小批次快速处理；高通量实验室则可能更看重容量。合适的平衡取决于具体工作流程（Socea et al., 2023）。

Illumina 或 NEB 试剂盒可以直接自动化吗？

只有在已有适用于准确试剂盒及其版本、仪器配置、耗材和模块的方法时，或实验室自行开发并验证了此类方法时，才可以。某个机器人上成功运行的方案只是该具体实现的证据，并不能保证可转移至其他平台（Hess et al., 2020）。

验证应该持续多长时间？

不存在对所有实验室都具有科学依据的固定周期。所需时间取决于预期用途、监管负担、样本多样性、验收标准、配对材料的可获得性、精密度条件数量、故障调查，以及研究期间方法或硬件是否发生变化（Socea et al., 2023）。

自动化文库和手工文库的产量应该完全相同吗？

不一定。关键在于预先定义的差异在文库 QC、测序 QC 和检测特异性终点上是否可以接受。Meijers 研究报告的结果总体可比，但也存在一个明显的浓度离群值；因此，终点层面的比较比宣称产量完全相同更有信息价值（Meijers et al., 2024）。

“无人值守”是否意味着完全不需要人工操作？

不是。设置、试剂准备、装载、台外转移、QC、恢复和审阅仍可能需要人工完成。在上述两项研究中，flowbot ONE 方法需要台外 PCR 操作和人工加入 index；Biomek i7 方法则需要在 9 小时仪器运行前进行约 2 小时的试剂准备（Meijers et al., 2024；Santacruz et al., 2022）。

参考文献

1. Head SR, Komori HK, LaMere SA, Whisenant T, Van Nieuwerburgh F, Salomon DR, Ordoukhanian P. Library construction for next-generation sequencing: overviews and challenges. BioTechniques. 2014;56(2):61–77. doi:10.2144/000114133.
2. Hess JF, Kohl TA, Kotrová M, Rönsch K, Paprotka T, Mohr V, Hutzenlaub T, Brüggemann M, Zengerle R, Niemann S, Paust N. Library preparation for next generation sequencing: A review of automation strategies. Biotechnology Advances. 2020;41:107537. doi:10.1016/j.biotechadv.2020.107537.
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5. Santacruz D, Enane FO, Fundel-Clemens K, Giner M, Wolf G, Onstein S, Klimek C, Smith Z, Wijayawardena B, Viollet C. Automation of high-throughput mRNA-seq library preparation: a robust, hands-free and time efficient methodology. SLAS Discovery. 2022;27(2):140–147. doi:10.1016/j.slasd.2022.01.002.
6. Santacruz D, et al. Corrigendum to “Automation of high-throughput mRNA-seq library preparation: a robust, hands-free and time efficient methodology.” SLAS Discovery. 2024;29(5):100169. doi:10.1016/j.slasd.2024.100169.
7. DeAngelis MM, Wang DG, Hawkins TL. Solid-phase reversible immobilization for the isolation of PCR products. Nucleic Acids Research. 1995;23(22):4742–4743. doi:10.1093/nar/23.22.4742.
8. Illumina. Illumina DNA Prep Reference Guide. Document 1000000025416 v12. 2026. 官方产品文档.
9. Illumina. Adapter dimers: causes, effects, and how to remove them. Knowledge Article #1911. 官方知识文章.

图像许可说明

图 1 和图 2 转引自 Meijers et al., Scientific Reports 14, 8159 (2024)，依据 Creative Commons Attribution 4.0 International License 使用。图像除显示缩放外未经改动。收录这些图像并不意味着作者、Flow Robotics、Illumina、Springer Nature 或任何其他具名组织对本文提供背书。