Как автоматизировать подготовку библиотек NGS: от ручного протокола к валидированному процессу

При подготовке библиотек NGS ДНК или РНК преобразуют в библиотеку, совместимую с платформой секвенирования. В зависимости от исследования процесс может включать фрагментацию или отбор по размеру, получение двуцепочечной ДНК, присоединение адаптеров, амплификацию, очистку и итоговое количественное определение. Качество библиотеки может влиять на сложность, систематические смещения, эффекты серии и полезность полученных данных секвенирования (Head et al., 2014).

Автоматизация позволяет стандартизировать повторяющиеся операции с жидкостями и сократить ручную работу, но способность робота выполнить протокол сама по себе не делает этот протокол валидным. Химия, конфигурация прибора, лабораторная посуда, программный метод, тип образца и назначение образуют единое исполнение, которое необходимо оценивать в комплексе. Поэтому обзоры автоматизации NGS отмечают как возможность устранить многоэтапное узкое место, так и необходимость соотнести стратегию с производительностью, гибкостью, доступом к контролю качества, кадровыми ресурсами и стоимостью (Hess et al., 2020; Socea et al., 2023).

Область применения. Это руководство по внедрению и валидации, а не стандартная операционная процедура для конкретного набора. Следуйте актуальным инструкциям именно для вашего набора подготовки библиотек и прибора. Клиническое или диагностическое применение также требует валидации по правилам, действующим в вашей лаборатории.

Пять этапов переноса

1. Определить назначение и границы автоматизации.
2. Преобразовать действующую ручную методику в однозначные машинные инструкции.
3. Отработать операции с жидкостями и магнитными частицами на выбранной рабочей платформе.
4. Сравнить автоматизированную методику с принятой ручной и проверить прецизионность.
5. Вводить методику в работу только при наличии документированных критериев приемки, контролей, обслуживания и управления изменениями.

Не существует универсального минимального размера серии, фиксированной длительности валидации или стандартного числа дополнительных реакций, гарантирующих успех. Эти параметры зависят от исследования, риска, прибора, модели затрат и требований лаборатории (Socea et al., 2023).

1. Определите, что прибор будет — и не будет — выполнять

Зафиксируйте точную версию набора, типы образцов, диапазон входного материала, желаемые размеры серий, платформу секвенирования и результат, который должен поддерживать процесс. Затем определите, какие операции остаются на станции дозирования, а какие требуют отдельного прибора или ручного переноса. Единой архитектуры автоматизации NGS нет: станции различаются дозирующими головками, магнитами, захватами, шейкерами, термостатированием, амплификаторами, ридерами, вместимостью платформы и гибкостью ПО (Hess et al., 2020; Socea et al., 2023).

Не называйте PCR или QC заведомо «ручными»: на одних системах они автоматизированы, на других выполняются вне платформы. Нельзя также приписывать прибору функцию опционального модуля, если этот модуль не установлен и не квалифицирован.

2. Преобразуйте ручной протокол в машиночитаемый метод

Ручные протоколы часто скрывают решения в формулировках «тщательно перемешать», «дождаться просветления» или «не задеть осадок». В машинном методе их заменяют явными проверяемыми параметрами. Для каждого этапа запишите как минимум:

• название реагента, чувствительные к серии требования, условия хранения и рабочий объем;
• исходную и приемную посуду, геометрию лунок и ориентацию планшета;
• объем, высоту и скорость аспирации и дозирования, задержки и при необходимости предварительное смачивание наконечника;
• объем, скорость и число циклов смешивания, а также возможность оседания частиц при ожидании;
• заданную температуру инкубации, подтвержденную температуру образца, продолжительность, крышку/пленку и время переноса;
• тип магнита, совместимость планшета, критерий окончания разделения, положение осадка и траекторию аспирации;
• политику наконечников, разделение зон до и после PCR и меры против загрязнения;
• каждое ручное вмешательство, безопасную остановку, восстановление и поле журнала аудита.

Инструкции производителя — исходное ограничение, а не деталь для позднего добавления. Например, действующая документация Illumina DNA Prep предписывает довести частицы очистки до комнатной температуры, перемешать на вортексе, медленно аспирировать и дозировать вязкую суспензию, дождаться просветления жидкости на магните, удалить остаточный этанол и соблюдать заданные этапы сушки и ресуспендирования (Illumina DNA Prep, document 1000000025416 v12). Автоматизированный метод должен воспроизводить назначение операций, не предполагая прямого переноса ручного жеста на робота.

Измеряйте запас, а не копируйте эмпирическое правило

Запас реагента должен покрывать доступный для аспирации остаток выбранного резервуара, особенности дозирования и потери конкретного процесса. Его нельзя безопасно задавать универсальным фиксированным числом дополнительных реакций. Meijers и соавторы использовали запас на четыре образца в своей восьмиобразцовой автоматизированной методике, тогда как руководство Illumina DNA Prep предписывает 20% запаса при приготовлении этанола для очистки. Это примеры конкретных реализаций, а не общие нормы (Meijers et al., 2024; Illumina DNA Prep v12).

3. Рассматривайте операции с магнитными частицами как управляемый процесс

Твердофазная обратимая иммобилизация (SPRI) первоначально была описана как обратимое связывание ДНК с карбоксилированными магнитными частицами в присутствии полиэтиленгликоля и соли в 96-луночной методике очистки продуктов PCR, рассчитанной на автоматизацию (DeAngelis et al., 1995). Эта работа не устанавливает универсального соотношения частиц, порога размера фрагмента, времени сушки или правила удаления димеров адаптеров для современных наборов NGS.

Для конкретного набора разработайте и проверьте:

• возвращение частиц к однородной суспензии до и во время дозирования;
• предписанные соотношение частиц и образца и порядок добавления;
• смешивание с достаточным выходом без избыточной пены и аэрозолей;
• время разделения и критерий просветления супернатанта;
• высоту и траекторию аспирации, удаляющие супернатант без захвата осадка;
• полное удаление промывки без пересушивания частиц;
• полное элюирование и ресуспендирование перед следующим переносом.

Эти факторы взаимодействуют. Низкий выход библиотеки может быть связан с качеством входного материала, ферментами, потерями при переносе, остаточным этанолом, пересушиванием или неполным элюированием, а не с единой «проблемой частиц». Illumina предупреждает, что остаточный этанол влияет на результат, а осадок нельзя пересушивать или задевать при промывке (Illumina DNA Prep v12).

У димеров адаптеров также несколько причин. Они содержат полные адаптеры без целевой вставки и расходуют риды, образуя кластеры на проточной ячейке. Illumina указывает среди причин малое количество или низкое качество входного материала и неэффективную очистку, а типичным признаком называет неожиданную вершину около 120–170 bp; корректирующие действия должны соответствовать конкретным набору и платформе (Illumina Knowledge Article #1911).

4. Спроектируйте валидацию до запуска сравнения

Определите критерии приемки до просмотра автоматизированных результатов. Дизайн должен отражать предполагаемые образцы и результат, а не фиксированный интернет-список. Socea и соавторы различают правильность, повторяемость, воспроизводимость, аналитическую чувствительность и специфичность, сравнение методов и отчетный результат; число образцов для оценки прецизионности должно определяться и утверждаться в системе валидации конкретной лаборатории (Socea et al., 2023).

Обоснованное сравнение обычно включает:

1. Сравнение методов. Подготовьте сопоставимый материал принятой ручной и новой автоматизированной методиками. По возможности выровняйте исходный материал, серии реагентов и последующее секвенирование.
2. Повторяемость. Повторите образцы в одном запуске для оценки вариации в одинаковых условиях.
3. Воспроизводимость. Повторите в значимых днях, у операторов, на приборах, сериях реагентов или запусках.
4. Диапазон и сложные образцы. Охватите разрешенные назначением входные диапазоны, матрицы, состояния качества и сложные условия.
5. Контроли загрязнения. Разместите отрицательные и информативные положительные контроли для выявления переноса и перепутывания.
6. Обработка отказов. Проверьте прерывания, отсутствие модулей, недостаточный объем, неуспешный QC и утвержденные процедуры восстановления или остановки.

Выбирайте метрики, связывающие библиотеку с конечным результатом

Одна метрика не доказывает эквивалентность. Концентрация может быть приемлемой при неудачном распределении фрагментов, загрязнении, покрытии или конечном результате. Head и соавторы обсуждают смещения, снижение сложности и эффекты серии, а Socea и соавторы — необходимость выбирать точки QC и критерии результата для назначения исследования (Head et al., 2014; Socea et al., 2023).

Что показывают — и чего не показывают — опубликованные сравнения

Публикации полезны как примеры дизайна, но не заменяют валидацию другого набора, прибора, типа образца или результата.

Полногеномное секвенирование бактерий: Illumina DNA Prep на flowbot ONE

Meijers и соавторы подготовили 16 бактериальных экстрактов ДНК ручным и автоматизированным процессами Illumina DNA Prep; восемь повторили в независимом автоматизированном запуске. Использовалась конкретная платформа flowbot ONE с дозированием, нагревом/охлаждением и магнитом; стрипы PCR переносили во внешний амплификатор, индексы добавляли вручную (Meijers et al., 2024).

Медианное различие концентрации библиотечной ДНК составило 1,5 раза, но значения не были идентичны: одна библиотека Klebsiella pneumoniae имела 10,9 ng/µL вручную и 1,9 ng/µL после автоматизации. После секвенирования и нормализации до миллиона ридов метрики сборки были сходными. Для 14 штаммов с видоспецифической схемой cgMLST комплексные типы совпали на 100%; для двух остальных подходящей схемы не было (Meijers et al., 2024).

Для серии из восьми образцов ручное время составляло 25 минут при автоматизации и 125 минут вручную; полный цикл — 170 и 200 минут. Это снижение ручного времени на 80%, но общего времени лишь на 15% в данной конфигурации, а не универсальное пятикратное ускорение NGS (Meijers et al., 2024).

mRNA-seq: NEBNext Ultra II Directional RNA на Biomek i7

Santacruz и соавторы сравнили ручные и автоматизированные библиотеки из 84 образцов РНК двух человеческих клеточных линий с набором NEBNext Ultra II Directional RNA и Biomek i7. Профили экспрессии тесно коррелировали. Двухдневный ручной протокол примерно на 12 часов заменили девятичасовым автономным запуском после примерно двух часов подготовки реагентов. Результаты относятся к 250 ng РНК, клеточным линиям, набору и станции исследования и не устанавливают характеристики для деградированных, низковходных, клинических или иных образцов (Santacruz et al., 2022; 2024 corrigendum).

Ищите причину по наблюдениям, а не по одному предположению

Один симптом может иметь несколько причин. Меняйте по одному обоснованному параметру, сохраняйте данные неудачи и повторяйте нужное сравнение вместо вывода «автоматизация не работает». После ввода нужны регулярные калибровка и обслуживание, компетентность персонала, мониторинг QC и контролируемое изменение скриптов (Socea et al., 2023).

Ссылки на оборудование: оценивайте метод, а не только размер платформы

Страница применения Pize для подготовки библиотек NGS перечисляет три связанные системы автоматизированной пробоподготовки. Это сводка текущего каталога Pize, не независимые данные валидации и не доказательство совместимости с конкретным набором.

Не считайте «30 позиций» «30 образцами», не принимайте опциональные модули за стандарт и не превращайте утверждение об очистке магнитными частицами для 384 образцов на iLab-300R в утверждение о подготовке библиотек NGS для 384 образцов. Запросите точную версию скрипта, карту рабочей платформы, список лабораторной посуды, валидированный диапазон входного материала, данные QC, оставшиеся ручные этапы, условия поддержки и процесс управления изменениями. Общая страница AMTK удобна для просмотра, но каталог не доказывает партнерство, регуляторный статус или пригодность для конкретной лаборатории.

После секвенирования: разделяйте валидацию мокрой лаборатории и анализа

Pize — ИИ-ассистент для программирования, предназначенный для научных вычислений и статистического анализа. Он работает в Pize Code и Positron, а также доступен как SDK. Эта программная роль отделена от метода станции: нельзя утверждать, что Pize управляет перечисленными приборами, квалифицирует или интегрирует их. Последующий анализ также следует документировать и валидировать для его назначения, как и мокрую лабораторию.

Часто задаваемые вопросы

При каком числе образцов автоматизация оправданна?

Универсального порога нет. Сравните ручное время, частоту и повторы серий, кадровые ограничения, использование реагентов и одноразовых материалов, обслуживание, загрузку прибора и объем валидации. Лаборатория с небольшим объемом работы может ценить быстрые малые серии, а лаборатория с большим объемом — отдавать приоритет производительности; баланс зависит от процесса (Socea et al., 2023).

Можно ли напрямую автоматизировать набор Illumina или NEB?

Только при наличии метода для точных набора и версии, конфигурации, посуды и модулей либо после собственной разработки и валидации. Успех на одном роботе — данные об этой реализации, не гарантия для другой платформы (Hess et al., 2020).

Сколько должна длиться валидация?

Единой научно обоснованной длительности нет. Срок зависит от назначения, регулирования, разнообразия образцов, критериев, парного материала, условий прецизионности, расследований и изменений метода/оборудования (Socea et al., 2023).

Должен ли выход ручных и автоматизированных библиотек совпадать?

Не обязательно. Важно, приемлемы ли заранее заданные различия по QC библиотеки, секвенирования и конечному результату. В Meijers результаты в целом сопоставимы, но есть явный выброс концентрации; сравнение конечных результатов информативнее заявления об одинаковом выходе (Meijers et al., 2024).

Означает ли «walk-away» отсутствие ручной работы?

Нет. Настройка, реагенты, загрузка, внешние переносы, QC, восстановление и проверка могут быть ручными. В flowbot ONE PCR выполняли вне платформы и индексы добавляли вручную; для Biomek i7 требовалось около двух часов подготовки перед девятичасовым запуском (Meijers et al., 2024; Santacruz et al., 2022).

Литература

1. Head SR, Komori HK, LaMere SA, Whisenant T, Van Nieuwerburgh F, Salomon DR, Ordoukhanian P. Library construction for next-generation sequencing: overviews and challenges. BioTechniques. 2014;56(2):61–77. doi:10.2144/000114133.
2. Hess JF, Kohl TA, Kotrová M, Rönsch K, Paprotka T, Mohr V, Hutzenlaub T, Brüggemann M, Zengerle R, Niemann S, Paust N. Library preparation for next generation sequencing: A review of automation strategies. Biotechnology Advances. 2020;41:107537. doi:10.1016/j.biotechadv.2020.107537.
3. Socea JN, Stone VN, Qian X, Gibbs PL, Levinson KJ. Implementing laboratory automation for next-generation sequencing: benefits and challenges for library preparation. Frontiers in Public Health. 2023;11:1195581. doi:10.3389/fpubh.2023.1195581.
4. Meijers E, Verhees FB, Heemskerk D, Wessels E, Claas ECJ, Boers SA. Automating the Illumina DNA library preparation kit for whole genome sequencing applications on the flowbot ONE liquid handler robot. Scientific Reports. 2024;14:8159. doi:10.1038/s41598-024-58963-2.
5. Santacruz D, Enane FO, Fundel-Clemens K, Giner M, Wolf G, Onstein S, Klimek C, Smith Z, Wijayawardena B, Viollet C. Automation of high-throughput mRNA-seq library preparation: a robust, hands-free and time efficient methodology. SLAS Discovery. 2022;27(2):140–147. doi:10.1016/j.slasd.2022.01.002.
6. Santacruz D, et al. Corrigendum to “Automation of high-throughput mRNA-seq library preparation: a robust, hands-free and time efficient methodology.” SLAS Discovery. 2024;29(5):100169. doi:10.1016/j.slasd.2024.100169.
7. DeAngelis MM, Wang DG, Hawkins TL. Solid-phase reversible immobilization for the isolation of PCR products. Nucleic Acids Research. 1995;23(22):4742–4743. doi:10.1093/nar/23.22.4742.
8. Illumina. Illumina DNA Prep Reference Guide. Document 1000000025416 v12. 2026. Официальная документация.
9. Illumina. Adapter dimers: causes, effects, and how to remove them. Knowledge Article #1911. Официальная статья.

Лицензия иллюстраций

Рисунки 1 и 2 воспроизведены из Meijers et al., Scientific Reports 14, 8159 (2024), по Creative Commons Attribution 4.0 International License (CC BY 4.0). Изображения не изменены, кроме масштаба отображения. Их включение не означает одобрения со стороны авторов, Flow Robotics, Illumina, Springer Nature или другой упомянутой организации.