NGS-Library-Präparation automatisieren: Vom manuellen Protokoll zum validierten Workflow

Bei der NGS-Library-Präparation wird DNA oder RNA in eine Library umgewandelt, die mit einer Sequenzierungsplattform kompatibel ist. Je nach Assay kann dies Fragmentierung oder Größenselektion, die Umwandlung in doppelsträngige DNA, das Anfügen von Adaptern, Amplifikation, Aufreinigung und abschließende Quantifizierung umfassen. Die Qualität der Library kann Komplexität, Bias, Batch-Effekte und den Nutzen der resultierenden Sequenzdaten beeinflussen (Head et al., 2014).

Automatisierung kann wiederkehrende Liquid-Handling-Schritte standardisieren und die aktive Arbeitszeit reduzieren. Ein Protokoll ist jedoch nicht allein deshalb valide, weil ein Roboter es ausführen kann. Chemie, Gerätekonfiguration, Labware, Softwaremethode, Probentyp und Verwendungszweck bilden gemeinsam eine Implementierung, die als Ganzes bewertet werden muss. Übersichtsarbeiten zur NGS-Automatisierung betonen daher sowohl die Möglichkeit, einen mehrstufigen Engpass zu verringern, als auch die Notwendigkeit, die Automatisierungsstrategie an Durchsatz, Flexibilität, Zugang zur Qualitätskontrolle, Personalausstattung und Kosten anzupassen (Hess et al., 2020; Socea et al., 2023).

Geltungsbereich. Dieser Artikel ist ein Implementierungs- und Validierungsleitfaden, keine kitspezifische Standardarbeitsanweisung. Befolgen Sie die aktuellen Anweisungen für Ihr konkretes Library-Präparationskit und Ihr konkretes Gerät. Eine klinische oder diagnostische Verwendung erfordert zusätzlich eine Validierung nach den für Ihr Labor geltenden Vorgaben.

Die Migration in fünf Teilen

1. Verwendungszweck und Grenze der Automatisierung festlegen.
2. Die bestehende manuelle Methode in eindeutige Maschinenanweisungen übersetzen.
3. Liquid-Handling- und Magnetbead-Schritte auf dem gewählten Deck entwickeln.
4. Die automatisierte Methode mit der akzeptierten manuellen Methode vergleichen und die Präzision prüfen.
5. Die Methode erst mit dokumentierten Akzeptanzkriterien, Kontrollen, Wartung und Änderungskontrolle freigeben.

Es gibt weder eine universelle Mindestbatchgröße noch eine feste Validierungsdauer oder eine Standardzahl zusätzlicher Reaktionen, die den Erfolg dieser Schritte garantiert. Diese Werte hängen von Assay, Risiko, Gerät, Kostenmodell und Laboranforderungen ab (Socea et al., 2023).

1. Festlegen, was das Gerät tun wird — und was nicht

Beginnen Sie mit der exakten Kitversion, den Probentypen, dem Eingabebereich, den gewünschten Batchgrößen, der Sequenzierungsplattform und dem Ergebnis, das der Workflow unterstützen muss. Entscheiden Sie anschließend, welche Arbeitsschritte auf dem Liquid Handler verbleiben und welche ein externes Gerät oder einen manuellen Transfer erfordern. NGS-Automatisierung ist keine einheitliche Architektur: Workstations unterscheiden sich hinsichtlich Pipettierköpfen, Magneten, Greifern, Schüttlern, Temperaturregelung, Thermocyclern, Readern, Deckkapazität und Softwareflexibilität (Hess et al., 2020; Socea et al., 2023).

Bezeichnen Sie PCR oder QC nicht grundsätzlich als „manuell“. Auf einigen Systemen sind sie automatisiert, auf anderen werden sie außerhalb des Decks durchgeführt. Ebenso darf einem Gerät mit optionalem Modul diese Funktion nur zugeschrieben werden, wenn das Modul tatsächlich installiert und qualifiziert ist.

2. Das manuelle Protokoll in eine maschinenlesbare Methode übersetzen

Ein manuelles Protokoll verbirgt Entscheidungen häufig in Formulierungen wie „gründlich mischen“, „warten, bis die Lösung klar ist“ oder „das Pellet nicht stören“. Eine Maschinenmethode muss solche Einschätzungen durch eindeutige, prüfbare Parameter ersetzen. Dokumentieren Sie für jeden Schritt mindestens Folgendes:

• Reagenzname, chargenabhängige Anforderungen, Lagerbedingung und Arbeitsvolumen;
• Quell- und Ziel-Labware, Wellgeometrie und Plattenorientierung;
• Aspirations- und Dispensierungsvolumen, Höhe, Geschwindigkeit, Verzögerungen und gegebenenfalls Vorbenetzung der Spitze;
• Mischvolumen, Geschwindigkeit, Zyklenzahl und die Frage, ob sich Beads während der Wartezeit der Platte absetzen können;
• Inkubationssollwert, verifizierte Probentemperatur, Dauer, Deckel oder Versiegelung und Transferzeit;
• Magnettyp, Plattenkompatibilität, Separationsendpunkt, Pelletposition und Aspirationsweg;
• Spitzenstrategie, Trennung von pre-PCR und post-PCR sowie Kontaminationskontrollen;
• jeden manuellen Eingriff, sicheren Haltepunkt, Wiederherstellungsschritt und jedes Audit-Log-Feld.

Die Herstelleranweisungen sind die Ausgangsbedingung und kein Detail, das später nachträglich eingepasst werden darf. Die aktuelle Dokumentation zu Illumina DNA Prep weist beispielsweise an, Aufreinigungsbeads auf Raumtemperatur zu bringen, zur Resuspension zu vortexen, die viskose Suspension langsam zu aspirieren und zu dispensieren, auf dem Magneten zu warten, bis die Flüssigkeit klar ist, Ethanolreste zu entfernen und definierte Trocknungs- und Resuspensionsschritte einzuhalten (Illumina DNA Prep, Dokument 1000000025416 v12). Eine automatisierte Methode muss den Zweck dieser Arbeitsschritte reproduzieren, ohne anzunehmen, dass sich ein manueller Handgriff unmittelbar auf einen Roboter übertragen lässt.

Überschuss messen, statt eine Faustregel zu übernehmen

Der Reagenzüberschuss muss das aspirierbare Restvolumen des ausgewählten Reservoirs, das Pipettierverhalten und die Verluste des tatsächlichen Workflows abdecken. Er lässt sich nicht sicher durch eine universelle feste Zahl zusätzlicher Reaktionen festlegen. Meijers und Kollegen verwendeten in ihrer konkreten automatisierten Methode mit acht Proben einen Reagenzüberschuss, der vier Proben entsprach, während das Handbuch zu Illumina DNA Prep für die Herstellung des Ethanols im Aufreinigungsschritt einen Überschuss von 20 % vorgibt. Beides sind implementierungsspezifische Beispiele und keine allgemeinen Standardwerte (Meijers et al., 2024; Illumina DNA Prep v12).

3. Magnetbead-Schritte als kontrollierten Prozess behandeln

Solid-Phase Reversible Immobilization (SPRI) wurde ursprünglich als reversible Bindung von DNA an carboxylierte Magnetpartikel in Gegenwart von Polyethylenglykol und Salz beschrieben. Dabei kam eine für die Automatisierung ausgelegte Methode zur Aufreinigung von PCR-Produkten in 96-Well-Platten zum Einsatz (DeAngelis et al., 1995). Diese grundlegende Arbeit legt weder ein universelles Bead-Verhältnis noch einen allgemeingültigen Grenzwert für die Fragmentgröße, eine Trocknungszeit oder eine Regel zur Entfernung von Adapterdimeren für moderne NGS-Kits fest.

Entwickeln und verifizieren Sie für das konkret verwendete Kit:

• wie die Beads vor und während der Dispensierung wieder in eine gleichmäßige Suspension überführt werden;
• das von der Methode vorgegebene Verhältnis von Beads zu Probe und die Reihenfolge der Zugabe;
• einen Mischvorgang, der eine gute Wiederfindung ohne übermäßige Schaumbildung oder Aerosolerzeugung erreicht;
• die Separationszeit und das Kriterium, anhand dessen entschieden wird, dass der Überstand klar ist;
• Aspirationshöhe und -weg, mit denen der Überstand entfernt wird, ohne das Pellet aufzunehmen;
• die vollständige Entfernung restlicher Waschlösung, ohne die Beads zu stark zu trocknen;
• vollständige Elution und Resuspension vor dem nächsten Transfer.

Diese Variablen beeinflussen sich gegenseitig. Eine geringe Library-Ausbeute kann beispielsweise auf die Qualität des Inputs, Enzymleistung, Transferverlust, Ethanolreste, zu starkes Trocknen oder unvollständige Elution zurückzuführen sein und nicht auf ein einziges universelles „Bead-Problem“. Illumina warnt ausdrücklich davor, dass Ethanolreste die Assay-Leistung beeinträchtigen können und dass Bead-Pellets während der Waschschritte weder zu stark getrocknet noch gestört werden dürfen (Illumina DNA Prep v12).

Adapterdimere können ebenfalls mehrere Ursachen haben. Sie enthalten vollständige Adaptersequenzen ohne das vorgesehene Insert und können Sequenzierungsreads verbrauchen, weil sie auf der Flow Cell Cluster bilden. Illumina nennt einen zu geringen oder qualitativ schlechten Input und eine ineffiziente Bead-Aufreinigung als mögliche Ursachen und beschreibt einen unerwarteten Peak bei etwa 120–170 bp als häufiges Anzeichen; die Korrekturmaßnahme muss sich dennoch nach dem konkreten Library-Kit und der Sequenzierungsplattform richten (Illumina Knowledge Article #1911).

4. Die Validierung vor Beginn des Vergleichs planen

Definieren Sie die Akzeptanzkriterien, bevor Sie die automatisierten Ergebnisse betrachten. Das Studiendesign sollte die vorgesehenen Probentypen und das beabsichtigte Ergebnis abbilden, nicht eine starre Checkliste aus dem Internet. Socea und Kollegen unterscheiden Richtigkeit, Wiederholpräzision, Reproduzierbarkeit, analytische Sensitivität und Spezifität, Methodenvergleich und berichtsfähigen Endpunkt. Zudem weisen sie darauf hin, dass die Probenzahlen für Präzisionsprüfungen innerhalb des Validierungsrahmens des jeweiligen Labors festgelegt und genehmigt werden sollten (Socea et al., 2023).

Ein belastbarer Vergleich umfasst üblicherweise:

1. Methodenvergleich. Präparieren Sie übereinstimmendes Material mit der akzeptierten manuellen Methode und der zu prüfenden automatisierten Methode. Halten Sie Ausgangsmaterial, Reagenzchargen und nachgelagerte Sequenzierungsbedingungen soweit möglich konstant.
2. Wiederholpräzision. Wiederholen Sie Proben innerhalb eines Laufs, um die Variation unter gleichen Bedingungen zu messen.
3. Reproduzierbarkeit. Wiederholen Sie die Untersuchung über relevante Tage, Bedienpersonen, Geräte, Reagenzchargen oder Läufe hinweg.
4. Messbereich und anspruchsvolle Proben. Bilden Sie den Eingabebereich, die Probenmatrizes, Qualitätszustände und schwierigen Bedingungen ab, die der Verwendungszweck tatsächlich zulässt.
5. Kontaminationskontrollen. Positionieren Sie Negativkontrollen und informative Positivkontrollen so, dass Verschleppung und Probenverwechslungen erkannt werden können.
6. Fehlerbehandlung. Prüfen Sie Unterbrechungen, nicht verfügbare Module, unzureichendes Volumen, fehlgeschlagene QC und jedes genehmigte Wiederherstellungs- oder Safe-Stop-Verfahren.

Metriken wählen, die die Library mit dem Endergebnis verbinden

Keine einzelne Metrik beweist Äquivalenz. Die Library-Konzentration kann akzeptabel erscheinen, während Fragmentverteilung, Kontamination, Abdeckung oder der assayspezifische Endpunkt nicht bestehen. Head und Kollegen erläutern, wie die Library-Herstellung Bias einführen, die Komplexität reduzieren und Batch-Effekte erzeugen kann. Socea und Kollegen zeigen, warum QC-Kontrollpunkte und ergebnisspezifische Kriterien passend zum vorgesehenen Assay gewählt werden müssen (Head et al., 2014; Socea et al., 2023).

Was veröffentlichte Vergleiche zeigen — und was nicht

Veröffentlichte Studien sind nützliche Beispiele für Studiendesigns. Sie ersetzen nicht die Validierung eines anderen Kits, Geräts, Probentyps oder Ergebnisses.

Bakterielle Gesamtgenomsequenzierung: Illumina DNA Prep auf flowbot ONE

Meijers und Kollegen präparierten 16 bakterielle DNA-Extrakte sowohl mit dem manuellen als auch mit dem automatisierten Workflow für Illumina DNA Prep. Acht dieser Extrakte wurden in einem unabhängigen automatisierten Lauf erneut verarbeitet. Die automatisierte Methode nutzte ein spezifisches Deck für flowbot ONE mit Pipettier-, Heiz-/Kühl- und Magnethardware. PCR-Röhrchenstreifen wurden zu einem externen Thermocycler übertragen und die Indizes manuell hinzugefügt (Meijers et al., 2024).

Die Studie berichtete einen medianen 1,5-fachen Unterschied der Library-DNA-Konzentration zwischen manueller und automatisierter Methode; die Werte waren jedoch nicht identisch: Eine Klebsiella-pneumoniae-Library ergab manuell 10,9 ng/µL und nach der Automatisierung 1,9 ng/µL. Nach Sequenzierung und Normalisierung auf eine Million Reads pro Library waren die Assemblierungsmetriken ähnlich. Bei den 14 Stämmen, für die ein speziesspezifisches cgMLST-Schema verfügbar war, stimmten die Komplex-Typen zu 100 % überein; für die verbleibenden zwei Stämme gab es kein anwendbares Schema (Meijers et al., 2024).

Für Batches von acht Proben in dieser Konfiguration betrug die aktive Arbeitszeit beim automatisierten Workflow 25 Minuten und beim manuellen Workflow 125 Minuten. Die Durchlaufzeit betrug 170 beziehungsweise 200 Minuten. Dies entspricht für den Studienaufbau einer Verringerung der aktiven Arbeitszeit um 80 %, aber einer Verkürzung der gesamten Durchlaufzeit um 15 % — nicht einer universellen Verfünffachung der Geschwindigkeit der NGS-Library-Präparation (Meijers et al., 2024).

mRNA-seq: NEBNext Ultra II Directional RNA auf Biomek i7

Santacruz und Kollegen verglichen manuelle und automatisierte Libraries aus 84 RNA-Proben, die aus zwei menschlichen Zelllinien stammten. Sie verwendeten das Kit NEBNext Ultra II Directional RNA und einen Biomek i7. Die Forschenden berichteten eng korrelierte Expressionsprofile. Die automatisierte Methode ersetzte ein zweitägiges, etwa zwölfstündiges manuelles Protokoll durch einen neunstündigen, bedienerfreien Gerätelauf nach ungefähr zwei Stunden Reagenzvorbereitung. Diese Ergebnisse gelten für den in der Studie verwendeten RNA-Input von 250 ng, die Zelllinienproben, das Kit und die Workstation; sie belegen keine Leistung für degradierte RNA-Proben, Proben mit geringem RNA-Input, klinische Proben oder andere RNA-Proben (Santacruz et al., 2022; Corrigendum von 2024).

Anhand von Beobachtungen untersuchen, nicht anhand einer einzigen vermuteten Ursache

Dasselbe Symptom kann durch mehrere Faktoren entstehen. Ändern Sie jeweils nur einen begründeten Parameter, bewahren Sie die Daten des fehlgeschlagenen Laufs auf und wiederholen Sie den relevanten Vergleich, statt zu erklären, die „Automatisierung funktioniert nicht“. Regelmäßige Kalibrierung, Wartung, Kompetenz des Personals, QC-Überwachung und ein kontrollierter Prozess für Skriptänderungen bleiben auch nach der ersten Freigabe erforderlich (Socea et al., 2023).

Gerätelinks: die Methode bewerten, nicht nur die Deckgröße

Die Pize-Anwendungsseite zur NGS-Library-Präparation führt drei verwandte Systeme zur automatisierten Probenvorbereitung auf. Die folgenden Beschreibungen fassen den aktuellen Pize-Katalog zusammen; sie sind keine unabhängigen Validierungsdaten und belegen keine Kompatibilität mit einem bestimmten Kit.

Interpretieren Sie „30 Positionen“ nicht als „30 Proben“, behandeln Sie optionale Module nicht als Standardausstattung und machen Sie aus der Aussage zur Magnetbead-Aufreinigung von 384 Proben beim iLab-300R keine Behauptung über eine NGS-Library-Präparation mit 384 Proben. Fordern Sie die genaue Skriptversion, den Deckplan, die Labware-Liste, den validierten Eingabebereich, QC-Daten, verbleibende manuelle Schritte, Supportvereinbarungen und das Änderungskontrollverfahren an. Die umfassendere AMTK-Katalogseite ist zum Durchsuchen nützlich, doch ein Katalogeintrag belegt weder eine Partnerschaft noch einen regulatorischen Status oder die Eignung für ein bestimmtes Labor.

Nach der Sequenzierung: Wet-Lab- und Analysevalidierung getrennt halten

Pize ist ein KI-Coding-Assistent für wissenschaftliches Rechnen und statistische Analysen. Pize läuft in Pize Code und Positron und ist auch als SDK verfügbar. Diese Softwarerolle ist von der Methode des Liquid Handlers getrennt: Pize darf nicht so beschrieben werden, als würde es die oben aufgeführten Geräte steuern, qualifizieren oder integrieren. Jeder nachgelagerte Analyseworkflow muss für seinen eigenen Verwendungszweck dokumentiert und validiert werden, genau wie der Wet-Lab-Workflow.

Häufig gestellte Fragen

Ab wie vielen Proben lohnt sich die Automatisierung?

Es gibt keinen universellen Schwellenwert. Vergleichen Sie die derzeitige aktive Arbeitszeit, Batchhäufigkeit, Wiederholungsrate, personelle Einschränkungen, den Verbrauch von Reagenzien und Einwegmaterialien, Wartung, Geräteauslastung und Validierungsaufwand. Ein Labor mit geringem Volumen kann schnelle kleine Batches schätzen, während ein Labor mit hohem Volumen möglicherweise die Kapazität priorisiert. Das angemessene Gleichgewicht hängt vom Workflow ab (Socea et al., 2023).

Kann ein Illumina- oder NEB-Kit direkt automatisiert werden?

Nur wenn für die genaue Kitversion, Gerätekonfiguration, Labware und Module eine Methode existiert — oder wenn das Labor eine solche Methode entwickelt und validiert. Ein Protokoll, das auf einem Roboter funktioniert, ist ein Nachweis für diese Implementierung und keine übertragbare Garantie für eine andere Plattform (Hess et al., 2020).

Wie lange sollte die Validierung dauern?

Es gibt keine wissenschaftlich vertretbare feste Dauer, die für jedes Labor gilt. Der Zeitbedarf hängt vom Verwendungszweck, den regulatorischen Anforderungen, der Probenvielfalt, den Akzeptanzkriterien, der Verfügbarkeit gepaarten Materials, der Anzahl der Präzisionsbedingungen, Fehleruntersuchungen und der Frage ab, ob sich Methode oder Hardware während der Studie ändern (Socea et al., 2023).

Müssen automatisierte und manuelle Libraries eine identische Ausbeute haben?

Nicht unbedingt. Entscheidend ist, ob vorab festgelegte Unterschiede bei Library-QC, Sequenzierungs-QC und dem assayspezifischen Endpunkt akzeptabel sind. Die Meijers-Studie berichtete insgesamt vergleichbare Ergebnisse, aber auch einen deutlichen Ausreißer bei der Konzentration. Deshalb ist der Vergleich auf Endpunktebene aussagekräftiger als die Behauptung einer identischen Ausbeute (Meijers et al., 2024).

Bedeutet „walk-away“, dass keine menschliche Arbeit erforderlich ist?

Nein. Einrichtung, Reagenzvorbereitung, Beladung, externe Transfers, QC, Wiederherstellung und Prüfung können manuell bleiben. In den beiden oben erörterten Studien erforderte die Methode mit flowbot ONE externe PCR-Handhabung und manuelle Indexzugabe, während die Methode mit Biomek i7 vor dem neunstündigen Gerätelauf etwa zwei Stunden Reagenzvorbereitung erforderte (Meijers et al., 2024; Santacruz et al., 2022).

Literatur

1. Head SR, Komori HK, LaMere SA, Whisenant T, Van Nieuwerburgh F, Salomon DR, Ordoukhanian P. Library construction for next-generation sequencing: overviews and challenges. BioTechniques. 2014;56(2):61–77. doi:10.2144/000114133.
2. Hess JF, Kohl TA, Kotrová M, Rönsch K, Paprotka T, Mohr V, Hutzenlaub T, Brüggemann M, Zengerle R, Niemann S, Paust N. Library preparation for next generation sequencing: A review of automation strategies. Biotechnology Advances. 2020;41:107537. doi:10.1016/j.biotechadv.2020.107537.
3. Socea JN, Stone VN, Qian X, Gibbs PL, Levinson KJ. Implementing laboratory automation for next-generation sequencing: benefits and challenges for library preparation. Frontiers in Public Health. 2023;11:1195581. doi:10.3389/fpubh.2023.1195581.
4. Meijers E, Verhees FB, Heemskerk D, Wessels E, Claas ECJ, Boers SA. Automating the Illumina DNA library preparation kit for whole genome sequencing applications on the flowbot ONE liquid handler robot. Scientific Reports. 2024;14:8159. doi:10.1038/s41598-024-58963-2.
5. Santacruz D, Enane FO, Fundel-Clemens K, Giner M, Wolf G, Onstein S, Klimek C, Smith Z, Wijayawardena B, Viollet C. Automation of high-throughput mRNA-seq library preparation: a robust, hands-free and time efficient methodology. SLAS Discovery. 2022;27(2):140–147. doi:10.1016/j.slasd.2022.01.002.
6. Santacruz D, et al. Corrigendum to “Automation of high-throughput mRNA-seq library preparation: a robust, hands-free and time efficient methodology.” SLAS Discovery. 2024;29(5):100169. doi:10.1016/j.slasd.2024.100169.
7. DeAngelis MM, Wang DG, Hawkins TL. Solid-phase reversible immobilization for the isolation of PCR products. Nucleic Acids Research. 1995;23(22):4742–4743. doi:10.1093/nar/23.22.4742.
8. Illumina. Illumina DNA Prep Reference Guide. Dokument 1000000025416 v12. 2026. Offizielle Produktdokumentation.
9. Illumina. Adapter dimers: causes, effects, and how to remove them. Knowledge Article #1911. Offizieller Wissensartikel.

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Abbildungen 1 und 2 werden nach Meijers et al., Scientific Reports 14, 8159 (2024), unter der Creative Commons Attribution 4.0 International License wiedergegeben. Die Bilder sind abgesehen von der Anzeigeskalierung unverändert. Ihre Aufnahme bedeutet keine Unterstützung oder Empfehlung durch die Autoren, Flow Robotics, Illumina, Springer Nature oder eine andere genannte Organisation.