Cómo automatizar la preparación de bibliotecas NGS: del protocolo manual a un flujo de trabajo validado

La preparación de bibliotecas NGS convierte ADN o ARN en una biblioteca compatible con una plataforma de secuenciación. Según el ensayo, este trabajo puede incluir fragmentación o selección por tamaño, conversión a ADN bicatenario, incorporación de adaptadores, amplificación, purificación y cuantificación final. La calidad de la biblioteca puede influir en la complejidad, los sesgos, los efectos de lote y la utilidad de los datos de secuencia resultantes (Head et al., 2014).

La automatización puede estandarizar la manipulación repetitiva de líquidos y reducir el trabajo manual, pero un protocolo no es válido simplemente porque un robot pueda ejecutarlo. La química, la configuración del instrumento, el material de laboratorio, el método de software, el tipo de muestra y el uso previsto forman una única implementación que debe evaluarse en conjunto. Por ello, las revisiones sobre automatización de NGS destacan tanto la oportunidad de reducir un cuello de botella con múltiples pasos como la necesidad de adaptar la estrategia de automatización al rendimiento, la flexibilidad, el acceso al control de calidad, la dotación de personal y el coste (Hess et al., 2020; Socea et al., 2023).

Alcance. Este artículo es una guía de implementación y validación, no un procedimiento operativo estándar específico de un kit. Siga las instrucciones vigentes para su kit concreto de preparación de bibliotecas y su instrumento. El uso clínico o diagnóstico también exige una validación conforme a las normas aplicables a su laboratorio.

La migración en cinco partes

1. Definir el uso previsto y los límites de la automatización.
2. Traducir el método manual actual en instrucciones explícitas para la máquina.
3. Desarrollar las operaciones de manipulación de líquidos y de perlas magnéticas en la plataforma elegida.
4. Comparar el método automatizado con el método manual aceptado y evaluar la precisión.
5. Poner el método en servicio únicamente con criterios de aceptación, controles, mantenimiento y control de cambios documentados.

No existe un tamaño mínimo universal de lote, una duración fija de validación ni un número predeterminado de reacciones adicionales que garantice el éxito de estos pasos. Esos valores dependen del ensayo, el riesgo, el instrumento, el modelo de costes y los requisitos del laboratorio (Socea et al., 2023).

1. Definir qué hará el instrumento — y qué no hará

Comience por la versión exacta del kit, los tipos de muestra, el intervalo de entrada, los tamaños de lote deseados, la plataforma de secuenciación y el resultado que debe respaldar el flujo de trabajo. A continuación, decida qué operaciones permanecerán en el manipulador de líquidos y cuáles requerirán un instrumento externo o una transferencia manual. La automatización de NGS no responde a una arquitectura única: las estaciones de trabajo difieren en sus cabezales de pipeteo, imanes, pinzas, agitadores, control de temperatura, termocicladores, lectores, capacidad de la plataforma y flexibilidad del software (Hess et al., 2020; Socea et al., 2023).

No clasifique la PCR o el QC como inherentemente «manuales». En algunos sistemas están automatizados y en otros se realizan fuera de la plataforma. Del mismo modo, no debe describirse un instrumento con un módulo opcional como si dispusiera de esa función, a menos que el módulo esté realmente instalado y cualificado.

2. Traducir el protocolo manual a un método legible por la máquina

Un protocolo manual suele ocultar decisiones en frases como «mezclar bien», «esperar hasta que esté transparente» o «evitar alterar el pellet». Un método para máquina debe sustituir esos juicios por parámetros explícitos y comprobables. Registre al menos lo siguiente en cada paso:

• nombre del reactivo, requisitos sensibles al lote, condiciones de almacenamiento y volumen de trabajo;
• material de laboratorio de origen y destino, geometría de los pocillos y orientación de la placa;
• volumen, altura y velocidad de aspiración y dispensación, pausas y, cuando proceda, prehumectación de la punta;
• volumen y velocidad de mezcla, número de ciclos y si las perlas pueden sedimentar mientras la placa espera;
• punto de consigna de la incubación, temperatura verificada de la muestra, duración, tapa o sellado y tiempo de transferencia;
• tipo de imán, compatibilidad de la placa, punto final de separación, ubicación del pellet y trayectoria de aspiración;
• política de puntas, segregación pre-PCR/post-PCR y controles de contaminación;
• cada intervención manual, punto de parada seguro, acción de recuperación y campo del registro de auditoría.

Las instrucciones del fabricante son la restricción inicial, no un detalle que pueda añadirse después. Por ejemplo, la documentación vigente de Illumina DNA Prep indica que las perlas de purificación deben llevarse a temperatura ambiente, agitarse en vórtex para resuspenderlas, aspirar y dispensar lentamente la suspensión viscosa, esperar a que el líquido se vuelva transparente sobre el imán, retirar el etanol residual y aplicar los pasos definidos de secado y resuspensión (Illumina DNA Prep, documento 1000000025416 v12). Un método automatizado debe reproducir la finalidad de esas operaciones sin asumir que un gesto manual se transfiere directamente a un robot.

Medir el exceso en lugar de copiar una regla práctica

El exceso de reactivo debe cubrir el volumen residual aspirable del depósito seleccionado, el comportamiento del pipeteo y las pérdidas del flujo de trabajo real. No puede definirse de forma segura mediante un número fijo y universal de reacciones adicionales. Meijers y sus colegas utilizaron un exceso de reactivo equivalente a cuatro muestras en su método automatizado específico para ocho muestras, mientras que el manual de Illumina DNA Prep especifica un exceso del 20 % al preparar el etanol para el paso de purificación. Ambos son ejemplos específicos de una implementación, no valores predeterminados generales (Meijers et al., 2024; Illumina DNA Prep v12).

3. Tratar las operaciones con perlas magnéticas como un proceso controlado

La Solid-Phase Reversible Immobilization (SPRI) se describió originalmente como la unión reversible del ADN a partículas magnéticas carboxiladas en presencia de polietilenglicol y sal, mediante un método de purificación de productos de PCR en placas de 96 pocillos diseñado para ser compatible con la automatización (DeAngelis et al., 1995). Ese artículo fundacional no establece una proporción universal de perlas, un umbral de tamaño de fragmento, un tiempo de secado ni una regla de eliminación de dímeros de adaptadores para los kits NGS modernos.

Para el kit concreto que se utilice, desarrolle y verifique:

• cómo devolver las perlas a una suspensión uniforme antes y durante la dispensación;
• la proporción entre perlas y muestra y el orden de adición especificados por el método;
• una mezcla que logre la recuperación sin generar espuma o aerosoles en exceso;
• el tiempo de separación y el criterio utilizado para determinar que el sobrenadante está transparente;
• la altura y la trayectoria de aspiración que permitan retirar el sobrenadante sin recoger el pellet;
• la eliminación completa de la solución de lavado residual sin secar las perlas en exceso;
• la elución y resuspensión completas antes de la siguiente transferencia.

Estas variables interactúan. Por ejemplo, un bajo rendimiento de la biblioteca puede deberse a la calidad de la entrada, el rendimiento enzimático, pérdidas durante la transferencia, etanol residual, secado excesivo o elución incompleta, en lugar de a un único «problema de perlas» universal. Illumina advierte expresamente que el etanol residual puede afectar al rendimiento del ensayo y que los pellets de perlas no deben secarse en exceso ni alterarse durante los pasos de lavado (Illumina DNA Prep v12).

Los dímeros de adaptadores también pueden tener varias causas. Contienen secuencias completas de adaptadores sin el inserto previsto y pueden consumir reads de secuenciación porque forman clústeres en la celda de flujo. Illumina señala entre las causas una entrada escasa o de mala calidad y una purificación ineficiente con perlas, y describe como signo frecuente un pico inesperado de aproximadamente 120–170 bp; aun así, la medida correctiva debe ajustarse al kit de biblioteca y a la plataforma de secuenciación concretos (Illumina Knowledge Article #1911).

4. Diseñar la validación antes de realizar la comparación

Defina los criterios de aceptación antes de examinar los resultados automatizados. El diseño del estudio debe reflejar los tipos de muestra y el resultado previstos, no una lista fija obtenida de Internet. Socea y sus colegas distinguen exactitud, repetibilidad, reproducibilidad, sensibilidad y especificidad analíticas, comparación de métodos y resultado notificable. También indican que el número de muestras para evaluar la precisión debe determinarse y aprobarse dentro del marco de validación de cada laboratorio (Socea et al., 2023).

Una comparación defendible suele incluir:

1. Comparación de métodos. Prepare material emparejado con el método manual aceptado y el método automatizado candidato. Cuando sea posible, mantenga alineados el material de entrada, los lotes de reactivos y las condiciones de secuenciación posteriores.
2. Repetibilidad. Repita muestras dentro de una misma ejecución para medir la variación en las mismas condiciones.
3. Reproducibilidad. Repita el estudio en los días, operadores, instrumentos, lotes de reactivos o ejecuciones pertinentes.
4. Intervalo y muestras difíciles. Represente el intervalo de entrada, las matrices de muestra, los estados de calidad y las condiciones difíciles que permita realmente el uso previsto.
5. Controles de contaminación. Coloque controles negativos y positivos informativos de modo que puedan detectarse el arrastre y los intercambios de muestras.
6. Gestión de fallos. Pruebe interrupciones, módulos no disponibles, volumen insuficiente, QC fallido y cualquier procedimiento aprobado de recuperación o parada segura.

Seleccionar métricas que conecten la biblioteca con el resultado final

Ninguna métrica por sí sola demuestra equivalencia. La concentración de la biblioteca puede parecer aceptable mientras fallan la distribución de fragmentos, la contaminación, la cobertura o el resultado específico del ensayo. Head y sus colegas explican cómo la construcción de bibliotecas puede introducir sesgos, reducir la complejidad y crear efectos de lote, mientras que Socea y sus colegas muestran por qué los puntos de control de QC y los criterios específicos del resultado deben elegirse de acuerdo con el ensayo previsto (Head et al., 2014; Socea et al., 2023).

Qué muestran las comparaciones publicadas — y qué no muestran

Los estudios publicados son ejemplos útiles de diseño experimental. No sustituyen la validación de un kit, instrumento, tipo de muestra o resultado diferentes.

Secuenciación del genoma completo de bacterias: Illumina DNA Prep en flowbot ONE

Meijers y sus colegas prepararon 16 extractos de ADN bacteriano con flujos de trabajo de Illumina DNA Prep tanto manuales como automatizados. Ocho de esos extractos volvieron a procesarse en una ejecución automatizada independiente. El método automatizado utilizó una configuración específica de flowbot ONE con hardware de pipeteo, calentamiento/refrigeración y separación magnética; las tiras de tubos de PCR se trasladaron a un termociclador externo y los índices se añadieron manualmente (Meijers et al., 2024).

El estudio notificó una diferencia mediana de 1,5 veces en la concentración de ADN de las bibliotecas entre los métodos manual y automatizado, pero los valores no fueron idénticos: una biblioteca de Klebsiella pneumoniae midió 10,9 ng/µL manualmente y 1,9 ng/µL tras la automatización. Después de la secuenciación y la normalización a un millón de reads por biblioteca, las métricas de ensamblaje fueron similares. En las 14 cepas para las que existía un esquema cgMLST específico de la especie, los tipos de complejo mostraron una concordancia del 100 %; las otras dos cepas no contaban con un esquema aplicable (Meijers et al., 2024).

Para lotes de ocho muestras con esa configuración, el tiempo de intervención manual fue de 25 minutos en el flujo de trabajo automatizado y de 125 minutos en el manual. El tiempo total de procesamiento fue de 170 y 200 minutos, respectivamente. Esto supone una reducción del 80 % del tiempo de intervención manual, pero del 15 % del tiempo total para esa configuración del estudio; no una aceleración universal de cinco veces en la preparación de bibliotecas NGS (Meijers et al., 2024).

mRNA-seq: NEBNext Ultra II Directional RNA en Biomek i7

Santacruz y sus colegas compararon bibliotecas manuales y automatizadas de 84 muestras de ARN derivadas de dos líneas celulares humanas, utilizando el kit NEBNext Ultra II Directional RNA y un Biomek i7. Notificaron perfiles de expresión estrechamente correlacionados. El método automatizado sustituyó un protocolo manual de dos días y aproximadamente 12 horas por una ejecución instrumental de nueve horas sin intervención, tras unas dos horas de preparación de reactivos. Estos resultados corresponden a la entrada de 250 ng de ARN, las muestras de líneas celulares, el kit y la estación de trabajo del estudio; no establecen el rendimiento con muestras de ARN degradadas, con una cantidad baja de ARN de entrada, clínicas o de otro tipo (Santacruz et al., 2022; corrección de 2024).

Resolver problemas a partir de las observaciones, no de una única causa supuesta

Más de un factor puede producir el mismo síntoma. Cambie un solo parámetro justificado cada vez, conserve la evidencia de la ejecución fallida y repita la comparación pertinente en lugar de declarar que «la automatización no funciona». La calibración y el mantenimiento rutinarios, la competencia del personal, la supervisión del QC y un proceso controlado para los cambios de scripts siguen siendo necesarios tras la puesta en servicio inicial (Socea et al., 2023).

Enlaces a instrumentos: evaluar el método, no solo el tamaño de la plataforma

La página de la aplicación de Pize para la preparación de bibliotecas NGS enumera tres sistemas relacionados de preparación automatizada de muestras. Las descripciones siguientes resumen el catálogo actual de Pize; no son datos de validación independientes ni demuestran la compatibilidad con un kit concreto.

No interprete «30 posiciones» como «30 muestras», no considere los módulos opcionales como estándar ni convierta la afirmación del iLab-300R sobre la purificación con perlas magnéticas de 384 muestras en una afirmación de preparación de bibliotecas NGS para 384 muestras. Solicite la versión exacta del script, el mapa de la plataforma, la lista de material de laboratorio, el intervalo de entrada validado, los datos de QC, los pasos manuales restantes, el acuerdo de asistencia y el proceso de control de cambios. La página general del catálogo AMTK resulta útil para explorar la oferta, pero una ficha de catálogo no demuestra una asociación, una situación regulatoria ni la idoneidad para un laboratorio concreto.

Después de la secuenciación: mantener separadas la validación de laboratorio húmedo y la del análisis

Pize es un asistente de programación con IA para computación científica y análisis estadístico. Funciona en Pize Code y Positron, y también se distribuye como SDK. Esta función de software es independiente del método del manipulador de líquidos: Pize no debe describirse como una herramienta que controle, cualifique o integre los instrumentos enumerados anteriormente. Todo flujo de trabajo de análisis posterior debe documentarse y validarse para su propio uso previsto, al igual que el flujo de trabajo de laboratorio húmedo.

Preguntas frecuentes

¿Cuántas muestras hacen que la automatización merezca la pena?

No existe un umbral universal. Compare el tiempo actual de intervención manual, la frecuencia de los lotes, la tasa de repetición, las limitaciones de personal, el uso de reactivos y consumibles, el mantenimiento, la utilización del instrumento y el esfuerzo de validación. Un laboratorio de bajo volumen puede valorar los lotes pequeños y rápidos; uno de alto volumen puede priorizar la capacidad. El equilibrio adecuado depende del flujo de trabajo (Socea et al., 2023).

¿Puede automatizarse directamente un kit de Illumina o NEB?

Solo cuando exista un método para el kit y la versión exactos, la configuración del instrumento, el material de laboratorio y los módulos, o cuando el laboratorio desarrolle y valide dicho método. Un protocolo que funciona en un robot constituye evidencia para esa implementación, no una garantía transferible a otra plataforma (Hess et al., 2020).

¿Cuánto debería durar la validación?

No existe una duración fija científicamente defendible que se aplique a todos los laboratorios. El tiempo depende del uso previsto, la carga regulatoria, la diversidad de las muestras, los criterios de aceptación, la disponibilidad de material emparejado, el número de condiciones de precisión, las investigaciones de fallos y si el método o el hardware cambian durante el estudio (Socea et al., 2023).

¿Deben tener un rendimiento idéntico las bibliotecas automatizadas y manuales?

No necesariamente. La cuestión es si las diferencias predefinidas son aceptables en el QC de la biblioteca, el QC de la secuenciación y el resultado específico del ensayo. El estudio de Meijers notificó resultados generalmente comparables, pero también un valor atípico claro en la concentración; por eso, la comparación a nivel del resultado ofrece más información que afirmar un rendimiento idéntico (Meijers et al., 2024).

¿«Walk-away» significa que no hay trabajo humano?

No. La configuración, la preparación de reactivos, la carga, las transferencias fuera de la plataforma, el QC, la recuperación y la revisión pueden seguir siendo manuales. En los dos estudios analizados, el método de flowbot ONE requería manipulación de PCR fuera de la plataforma y adición manual de índices, mientras que el método de Biomek i7 requería aproximadamente dos horas de preparación de reactivos antes de la ejecución instrumental de nueve horas (Meijers et al., 2024; Santacruz et al., 2022).

Referencias

1. Head SR, Komori HK, LaMere SA, Whisenant T, Van Nieuwerburgh F, Salomon DR, Ordoukhanian P. Library construction for next-generation sequencing: overviews and challenges. BioTechniques. 2014;56(2):61–77. doi:10.2144/000114133.
2. Hess JF, Kohl TA, Kotrová M, Rönsch K, Paprotka T, Mohr V, Hutzenlaub T, Brüggemann M, Zengerle R, Niemann S, Paust N. Library preparation for next generation sequencing: A review of automation strategies. Biotechnology Advances. 2020;41:107537. doi:10.1016/j.biotechadv.2020.107537.
3. Socea JN, Stone VN, Qian X, Gibbs PL, Levinson KJ. Implementing laboratory automation for next-generation sequencing: benefits and challenges for library preparation. Frontiers in Public Health. 2023;11:1195581. doi:10.3389/fpubh.2023.1195581.
4. Meijers E, Verhees FB, Heemskerk D, Wessels E, Claas ECJ, Boers SA. Automating the Illumina DNA library preparation kit for whole genome sequencing applications on the flowbot ONE liquid handler robot. Scientific Reports. 2024;14:8159. doi:10.1038/s41598-024-58963-2.
5. Santacruz D, Enane FO, Fundel-Clemens K, Giner M, Wolf G, Onstein S, Klimek C, Smith Z, Wijayawardena B, Viollet C. Automation of high-throughput mRNA-seq library preparation: a robust, hands-free and time efficient methodology. SLAS Discovery. 2022;27(2):140–147. doi:10.1016/j.slasd.2022.01.002.
6. Santacruz D, et al. Corrigendum to “Automation of high-throughput mRNA-seq library preparation: a robust, hands-free and time efficient methodology.” SLAS Discovery. 2024;29(5):100169. doi:10.1016/j.slasd.2024.100169.
7. DeAngelis MM, Wang DG, Hawkins TL. Solid-phase reversible immobilization for the isolation of PCR products. Nucleic Acids Research. 1995;23(22):4742–4743. doi:10.1093/nar/23.22.4742.
8. Illumina. Illumina DNA Prep Reference Guide. Documento 1000000025416 v12. 2026. Documentación oficial del producto.
9. Illumina. Adapter dimers: causes, effects, and how to remove them. Knowledge Article #1911. Artículo oficial de la base de conocimientos.

Nota sobre la licencia de las figuras

Las figuras 1 y 2 se reproducen de Meijers et al., Scientific Reports 14, 8159 (2024), bajo la Creative Commons Attribution 4.0 International License. Las imágenes no se han modificado, salvo por el escalado de visualización. Su inclusión no implica el respaldo de los autores, Flow Robotics, Illumina, Springer Nature ni de ninguna otra organización mencionada.