Передовые методы микроскопии
Рамановская микроскопия (CARS и SRS)
Когерентное антистоксово рамановское рассеяние (CARS) и стимулированное рамановское рассеяние (SRS) применяются для быстрой и высокочувствительной визуализации молекулярных колебаний без использования меток.
Описание
Что дают методы CARS и SRS
Визуализация молекулярных колебаний обеспечивает химическую специфичность, полезную в биологической микроскопии, фармацевтических исследованиях и материаловедении, особенно когда другие методы микроскопии дают неоднозначные результаты, а использование меток невозможно. Микроскопия спонтанного рамановского рассеяния чувствительна, но работает медленно. Её нелинейные аналоги — когерентное антистоксово рамановское рассеяние (CARS) и стимулированное рамановское рассеяние (SRS) — позволяют выполнять высокоскоростную и высокочувствительную безметочную визуализацию молекулярных колебаний.
Различия между CARS и SRS
В микроскопии CARS два пучка создают через колебательный уровень образца излучение на третьей длине волны. Разность энергий двух пучков можно настраивать на разные колебательные уровни, формируя химический контраст изображения. Сигнал CARS возникает на другой длине волны и обычно свободен от фона, поэтому его сравнительно легко регистрировать. Однако CARS искажает форму колебательных линий и содержит нерезонансную составляющую сигнала, что затрудняет химическую интерпретацию. Метод SRS лишён этих недостатков, но его сигнал представляет собой небольшую модуляцию одного из входящих пучков и требует сложной схемы регистрации.
CRONUS-2P для двухпучковой рамановской микроскопии
CRONUS-2P — фемтосекундный лазер с тремя одновременными синхронизированными выходами, высокой частотой повторения импульсов, высокой выходной мощностью, короткой длительностью импульса и управлением GDD. Два выхода независимо перестраиваются в диапазонах 680–960 nm и 940–1300 nm, а третий имеет фиксированную длину волны 1025 nm. Три одновременных выхода обеспечивают расширенные применения CARS и SRS: двухдиапазонную визуализацию, более широкий выбор частот колебательного резонанса, согласованную перестройку двух пучков с постоянной разностью частот и резонансное усиление.
SRS полимерных материалов
(a) Спектры спонтанного рамановского рассеяния и SRS полимерных материалов, нормированные по максимальному пику исследуемой молекулы. (b) Изображения SRS окрашенных и неокрашенных микросфер PS. Изображения зарегистрированы с использованием CRONUS-2P.
SRS клеток и β-каротина
(a) Визуализация ядер фиксированных клеток HeLa, окрашенных AZ568, методом SRS (красный) и по флуоресценции (зелёный). (b) Спектры SRS и спонтанного рамановского рассеяния (при 488 nm) раствора AZ568 концентрацией 1 mM в DMSO-d6. (c) Структура β-каротина. (d) Спектр β-каротина, зарегистрированный методами SRS и спонтанного рамановского рассеяния. (e) Спектр раствора β-каротина в DMSO-d6, полученный методом спектральной фокусировки. Изображения зарегистрированы с использованием CRONUS-2P.
