Microscopie avancée
Microscopie Raman (CARS et SRS)
CARS et SRS servent à l’imagerie vibrationnelle rapide, sensible et sans marqueur.
Présentation
Ce qu’apportent CARS et SRS
L’imagerie vibrationnelle fournit une spécificité chimique, utile en microscopie biologique ainsi qu’en sciences pharmaceutiques et des matériaux, en particulier lorsque d’autres techniques de microscopie donnent des résultats ambigus et que des marqueurs ne peuvent pas être utilisés. La microscopie par diffusion Raman spontanée, bien que sensible, est lente. Toutefois, ses homologues non linéaires – la diffusion Raman anti-Stokes cohérente (CARS) et la diffusion Raman stimulée (SRS) – peuvent être utilisées pour une imagerie vibrationnelle rapide, à haute sensibilité et sans marqueur.
En quoi CARS et SRS diffèrent
En microscopie CARS, deux faisceaux sont utilisés pour produire un rayonnement à une troisième longueur d’onde via un niveau vibrationnel de l’échantillon. La différence d’énergie entre les deux faisceaux peut être accordée sur différents niveaux vibrationnels, fournissant ainsi un contraste d’imagerie chimique. Le signal CARS produit se situe à une longueur d’onde différente, généralement exempte de fond, ce qui rend sa détection relativement simple. Toutefois, CARS déforme les profils de raies vibrationnelles et possède une composante de signal non résonante, ce qui complique l’attribution chimique. SRS est exempt de ces inconvénients ; son signal est cependant une faible modulation sur l’un des faisceaux incidents et exige un schéma de détection élaboré.
CRONUS-2P pour le Raman à deux faisceaux
CRONUS-2P est un laser femtoseconde fournissant trois sorties simultanées et synchronisées, à haut taux de répétition, haute puissance de sortie, courte durée d’impulsion et contrôle de la GDD. Deux sorties sont accordables indépendamment dans les plages 680–960 nm et 940–1300 nm, tandis que la troisième est fixe à 1025 nm. Les trois sorties simultanées permettent des applications CARS et SRS avancées, avec imagerie à double bande, un choix plus large de fréquences de résonance vibrationnelle, un accord à deux faisceaux à différence constante et un renforcement résonant.
SRS de matériaux polymères
(a) Spectres Raman spontanés et SRS de matériaux polymères, normalisés sur le pic maximal de la molécule d’intérêt. (b) Images SRS de billes de PS teintes et non teintes. Les images ont été enregistrées à l’aide de CRONUS-2P.
SRS de cellules et de β-carotene
(a) Imagerie des noyaux de cellules HeLa fixées, colorées à l’AZ568, par SRS (rouge) et fluorescence (vert). (b) Spectre SRS et Raman spontané (à 488 nm) d’une solution 1 mM d’AZ568 dans le DMSO-d6. (c) Structure du β-carotene. (d) Spectre de β-Carotene enregistré par SRS et Raman spontané. (e) Spectre de focalisation spectrale d’une solution de β-carotene dans le DMSO-d6. Les images ont été enregistrées à l’aide de CRONUS-2P.
