Передовые методы микроскопии
Нелинейная микроскопия биологических тканей
Нелинейная микроскопия — мощный метод визуализации внутри живых организмов с субмикронным разрешением на глубинах порядка миллиметров.
Описание
Что такое нелинейная микроскопия биологических тканей?
Нелинейная микроскопия — мощный метод визуализации внутри живых организмов с субмикрометровым разрешением на глубине порядка миллиметров. В сочетании с генетически кодируемыми индикаторами кальция и опсинами микроскопия многофотонно-возбуждаемой флуоресценции (MPEF) произвела революцию в нейровизуализации и становится стандартным инструментом нейробиологии. Безметочные методы, такие как генерация второй и третьей гармоник (SHG и THG), когерентное антистоксово и стимулированное рамановское рассеяние (CARS и SRS), превратились в сверхчувствительные методы структурной и химической визуализации.
Формирование контраста
Для нелинейных оптических процессов, лежащих в основе нелинейной микроскопии, требуется высокая интенсивность света. Её можно получить при низкой средней мощности, если плотно сфокусировать ультракороткие световые импульсы. Это свойство используют для оптического секционирования и повышения контраста изображения глубоко внутри рассеивающих тканей. Многофотонное возбуждение происходит, когда два или более фотона одновременно взаимодействуют с молекулой и их суммарная энергия вызывает возбуждение, приводящее к флуоресценции. Одновременное поступление нескольких фотонов может также вызвать генерацию гармоник — излучения с удвоенной или утроенной частотой возбуждающего лазера. Генерация гармоник создаёт собственный безметочный контраст, который определяется молекулярной упорядоченностью и однородностью образца и используется для их характеристики.
Трёх- и четырёхфотонная визуализация
Особого внимания заслуживает микроскопия флуоресценции высших порядков с трёх- и четырёхфотонным возбуждением (3PEF и 4PEF). Она позволяет получать изображения на глубинах, недоступных традиционным методам микроскопии, особенно в сильно рассеивающих образцах, таких как головной мозг. Что особенно важно, современные лазерные источники способны работать с требуемой частотой повторения импульсов и обеспечивать энергию импульса, необходимую для функциональной визуализации мозга в реальном времени на биологически значимых глубинах.
Используемые источники
CRONUS-2P и CRONUS-3P — фемтосекундные источники, разработанные для нелинейной микроскопии. Они охватывают задачи функциональной нейровизуализации, оптогенетики и глубинной визуализации: трёхфотонное возбуждение со средней частотой повторения импульсов, быструю двухфотонную визуализацию с высокой частотой повторения, а также широкопольное и голографическое возбуждение с помощью мощных лазерных источников.
Данио-рерио при возбуждении 1300 nm
Мультимодальная 3D-визуализация живой рыбы данио-рерио при возбуждении 1300 nm с использованием CRONUS-3P. 3PEF — зелёный; trans SHG — жёлтый; epi THG — тёмно-синий; trans THG — голубой. Предоставлено группой Luigi Bonacina, Женевский университет.
Данио-рерио при возбуждении 1300 nm (2024)
Мультимодальная 3D-визуализация живой рыбы данио-рерио при возбуждении 1300 nm с использованием CRONUS-3P. 3PEF — зелёный; trans SHG — жёлтый; epi THG — тёмно-синий; trans THG — голубой. Предоставлено группой Luigi Bonacina, Женевский университет (2024).
