Microscopie avancée
Microscopie non linéaire dans les tissus biologiques
La microscopie non linéaire image l’intérieur d’organismes vivants à résolution submicrométrique sur des millimètres.
Présentation
Qu’est-ce que la microscopie non linéaire dans les tissus ?
La microscopie non linéaire est une technique puissante pour imager l’intérieur d’organismes vivants avec une résolution submicrométrique à des profondeurs millimétriques. Associée à des indicateurs calciques et à des opsines génétiquement encodés, la microscopie de fluorescence multiphotonique (MPEF) a révolutionné la neuro-imagerie et devient un outil standard en neurosciences. Des méthodes sans marqueur telles que la génération de seconde et de troisième harmoniques (SHG et THG), ainsi que la diffusion Raman anti-Stokes cohérente et la diffusion Raman stimulée (CARS et SRS), ont été développées en techniques d’imagerie structurelle et chimique ultrasensibles.
Comment se forme le contraste
Les processus d’optique non linéaire de la microscopie non linéaire exigent de hautes intensités lumineuses, qui peuvent être atteintes à faible puissance moyenne lorsque des impulsions lumineuses ultracourtes sont fortement focalisées. Cette propriété est exploitée pour assurer un sectionnement optique et améliorer le contraste d’imagerie en profondeur dans les tissus diffusants. L’excitation multiphotonique se produit lorsque deux photons ou plus passent simultanément au voisinage d’une molécule et que leur énergie combinée sert à l’excitation, conduisant à la fluorescence. L’arrivée simultanée de plusieurs photons peut également donner lieu à la génération d’harmoniques – un rayonnement au double ou au triple de la fréquence du laser d’excitation. La génération d’harmoniques est un contraste intrinsèque sans marqueur, déterminé par l’ordre moléculaire et l’homogénéité de l’échantillon, et utilisé pour les caractériser.
Imagerie à trois et quatre photons
La microscopie de fluorescence excitée à trois et quatre photons d’ordre supérieur (3PEF et 4PEF) mérite une attention particulière, car elle permet d’imager à des profondeurs inaccessibles aux techniques de microscopie conventionnelles, en particulier dans des échantillons fortement diffusants tels que le cerveau. Plus important encore, les sources laser modernes peuvent fonctionner aux taux de répétition requis et fournir l’énergie d’impulsion nécessaire à l’imagerie cérébrale fonctionnelle en temps réel à des profondeurs biologiquement pertinentes.
Sources utilisées pour ce travail
CRONUS-2P et CRONUS-3P sont des sources femtoseconde conçues pour la microscopie non linéaire. Elles couvrent la neuro-imagerie fonctionnelle, l’optogénétique et l’imagerie profonde par excitation à trois photons à taux de répétition moyen, ainsi que l’imagerie rapide à deux photons à haut taux de répétition, de même que l’excitation en champ large et holographique à l’aide de sources laser de haute puissance.
Poisson-zèbre à 1300 nm
Imagerie 3D multimodale d’un poisson-zèbre vivant à une excitation de 1300 nm à l’aide de CRONUS-3P. 3PEF – vert, trans SHG – jaune, epi-THG – bleu foncé, trans-THG – cyan. Avec l’aimable autorisation de Luigi Bonacina group, University of Geneva.
Poisson-zèbre à 1300 nm (2024)
Imagerie 3D multimodale d’un poisson-zèbre vivant à une excitation de 1300 nm à l’aide de CRONUS-3P. 3PEF – vert, trans SHG – jaune, epi-THG – bleu foncé, trans-THG – cyan. Avec l’aimable autorisation de Luigi Bonacina group, University of Geneva (2024).
