先端顕微鏡
生体組織の非線形顕微鏡
非線形顕微鏡はミリメートル深さで亜マイクロメートル分解能の生体内部成像を行う。
製品紹介
組織における非線形顕微鏡とは何か
非線形顕微鏡は、生きた生物の内部をミリメートル深さで亜マイクロメートル分解能によりイメージングする有力な手法である。遺伝的にコードされたカルシウム指示薬およびオプシンと組み合わせることで、多光子蛍光（MPEF）顕微鏡は神経イメージングを一変させ、神経科学の標準的なツールとなりつつある。第二次および第三次高調波発生（SHGおよびTHG）、ならびにコヒーレントアンチストークスおよび誘導ラマン散乱（CARSおよびSRS）などのラベルフリー手法は、超高感度の構造および化学イメージング手法へと発展している。
コントラストの形成
非線形顕微鏡の非線形光学過程には高い光強度が必要であり、超短光パルスを強く集光すれば低い平均パワーで到達できる。この特徴を利用して光学セクショニングを実現し、散乱組織深部のイメージングコントラストを改善する。多光子励起は、2個以上の光子が分子近傍を同時に通過し、それらの合算エネルギーが励起に使われて蛍光に至るときに生じる。複数光子の同時到達は高調波発生、すなわち励起レーザー周波数の2倍または3倍の放射にもなり得る。高調波発生は、試料の分子秩序および均一性によって決まり、それらを特徴付けるために用いられる内在的なラベルフリーコントラストである。
三光子および四光子イメージング
より高次の三光子および四光子励起蛍光（3PEFおよび4PEF）顕微鏡は、従来の顕微鏡手法では到達できない深さでのイメージングを可能にするため、とくに脳のような強散乱試料において特記に値する。最も重要な点として、現代のレーザー光源は必要な繰り返し周波数で動作し、生物学的に意味のある深さでのリアルタイム機能的脳イメージングに必要なパルスエネルギーを供給できる。
本研究に用いた光源
CRONUS-2PおよびCRONUS-3Pは、非線形顕微鏡向けに作られたフェムト秒光源である。機能的神経イメージング、オプトジェネティクス、および中繰り返し周波数の三光子励起による深部イメージングと高速な高繰り返し周波数二光子イメージングをカバーし、さらに高出力レーザー光源によるワイドフィールドおよびホログラフィック励起もカバーする。
1300 nmにおけるゼブラフィッシュ
CRONUS-3Pを用いた、1300 nm励起における生きたゼブラフィッシュのマルチモーダル3Dイメージング。3PEF – 緑、trans SHG – 黄、epi-THG – 濃紺、trans-THG – シアン。提供：Luigi Bonacina group, University of Geneva。
1300 nmにおけるゼブラフィッシュ（2024）
CRONUS-3Pを用いた、1300 nm励起における生きたゼブラフィッシュのマルチモーダル3Dイメージング。3PEF – 緑、trans SHG – 黄、epi-THG – 濃紺、trans-THG – シアン。提供：Luigi Bonacina group, University of Geneva（2024）。
